| 研究概要 |
SH3ドメインはプロリンリッチ配列(PXXP配列)に結合するドメインである。任意のSH3ドメインに対する機能阻害ペプチドをデザインする一般的な方法を開発することを目的とする。
p67^<phox>蛋白質のSH3ドメインをGST融合タンパク質として大腸菌を用いて発現・精製した.Glutathione coated 96穴HS plateプレートを用いてGST部分でプラスチックに結合させ,方向が制御された状態の固相化をおこなった.タンパク質に非特異的に吸着するファージは、固相化したBSAに吸着するものを排除することで除いた。また,溶液中での選択を行うためGST Magnet Agarose Beadsを用いてプルダウンを行った.特異的に吸着したファージを溶出し、大腸菌に感染させ、プラークを得た。このパンニング操作を3回繰り返した。市販のファージライブラリPh.D.-C7C及びPh.D.-D12ファージディスプレイペプチドライブラリキット(BioLabs社)を用いた.それぞれ,7残基と12残基のランダムライブラリであり,Ph.D.-C7Cは両端のシステインがSS結合を形成する.結果はファージELISAを使って確認した.Ph-D.-C7CライブラリではPXXPを含む配列が繰り返し得られた.これはSS結合でコンホメーションが制限されていることを考えると大変興味深い.そこで,得られた4つのアミノ酸配列をペプチド合成し,SS結合を作らせた.^<15>Nラベルしたp67^<phox>蛋白質のSH3ドメインを調製した.これにペプチドを滴定しNMRスペクトル変化を見ることで相互作用の有無を確認する.現在までに得られている予備的な結果では2つのペプチドで変化が見られている.
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