| 研究課題/領域番号 |
16658084
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| 研究機関 | 独立行政法人水産総合研究センター |
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研究代表者 |
中易 千早 独立行政法人水産総合研究センター, 養殖研究所病害防除部健康管理研究グループ, 研究員 (00311225)
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| 研究分担者 |
松山 知正 独立行政法人水産総合研究センター, 養殖研究所病害防除部健康管理研究グループ, 研究員 (20372021)
藤原 篤志 独立行政法人水産総合研究センター, 養殖研究所病害防除部健康管理研究グループ, 派遣研究員
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| キーワード | DNAチップ / ヒラメ / 免疫関連遺伝子 / マイクロアレイ / Edwardsiella tarda |
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| 研究概要 |
本年度の予定はE.tarda感染ヒラメの白血球で特異的に発現される免疫関連遺伝子群をサブトラクション法で選抜し、得られた遺伝子をPCRで増幅させ、DNAチップを作製するための材料を用意することである。ヒラメに対してE.tardaを用いて予備感染試験を行ったところ、感染後5日目から大量へい死が観察された。よって、再度、感染試験を行い、感染後1日目と3日目に採血を行い、比重遠心分離により末梢血白血球を採取した。得られた白血球からTRIzolを用いてRNAを抽出した。また、未感染のヒラメからも同様の方法で白血球RNAを抽出した。得られた感染魚あるいは未感染魚由来のRNAをそれぞれ鋳型として、SMART法によりcDNAを合成し、アダプターを連結させた。さらにDNA Subtraction Kitを用いて、感染魚由来遺伝子から未感染魚由来遺伝子を二本鎖に形成およびアダプターを利用したPCRを行うことで指し引いた。この操作により、感染に対して特異的に発現する遺伝子を得た。得られた遺伝子をベクターに連結後、大腸菌にTransformationし、感染特異的cDNAライブラリーを作製した。このcDNAライブラリーから768個の遺伝子をランダムに選抜し、コロニーPCRでインサートチェックを行った後、ベクターに対するプライマーを用いてPCRを行い、これらの遺伝子を増幅させた。次に次年度の予定を前倒しして、各遺伝子のPCR産物をスライドグラスにスポットさせ、DNAチップの作製を行った。さらに、E.tarda感染魚および未感染魚の白血球RNAをそれぞれCy3およびCy5で蛍光標識し、本DNAチップにアプライした。その結果、非感染に比べ感染魚で発現増加している遺伝子が検出可能であった。本チップにより遺伝子の発現状況を解析することが可能であることを確認した。
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