| 研究課題/領域番号 |
16659050
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
栗原 秀剛 順天堂大学, 医学部, 助教授 (80311976)
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| 研究分担者 |
坂井 建雄 順天堂大学, 医学部, 教授 (90114488)
市村 浩一郎 順天堂大学, 医学部, 助手 (10343485)
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| キーワード | ラット / 足細胞 / 内皮細胞 / スリット膜 / 三次元培養 / 細胞骨格 / 免疫組織化学 / タイムラプス |
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| 研究概要 |
糸球体足細胞は、分裂能を失って高度に分化した細胞であり、血液を濾過し原尿を生成するために重要な役割を演じている。申請者らはこれまでにSV40T抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラットより糸球体を単離し、そこから糸球体構成細胞の不死化培養株を樹立した。本研究においては、それらの培養細胞株を用いてin vitroで糸球体構造を三次元的に構築することを目的としている。本年度は、スクリーニングした毛細血管内皮細胞培養株がマトリゲル内で管腔形成能を有し、外側に基底膜様構造を作ることを電子顕微鏡で確認した。毛細血管様構造を作った後に、足細胞培養株を加えることにより、血管の外側に足細胞が結合するため、in vivoと同じ位置関係に2つの細胞を置くことができる。この条件で足細胞はフラットな構造から、本来の細胞体が盛り上がったたこ足構造を有し、コンフォーカル顕微鏡を用いて、ディッシュ培養下で発現が見られなかった中間径線維関連分子p250の発現が細胞質に確認できた。さらに、得られた足細胞培養株についてスリット膜関連分子の発現を調べた結果、いくつかのクローンについてネフリン、Neph1の安定した発現をPCRにて確認した。33度と37度で比較したところ、ネフリンの発現は37度で増加した。ネフリンの発現を有していないC7クローンについてポドカリキシンの遺伝子を導入したところ、ネフリンの発現が認められた。特にD7クローンにおいては、免疫組織化学により細胞膜にネフリンの局在を観察した。しかしながら、電顕観察でスリット膜の存在は確認できていない。いずれのクローンにおいてもポドシンの発現が認められないことから、ポドシン遺伝子を導入してネフリンの発現変化を調べたが、ネフリンの発現量および局在に変化は認められなかった。これらの結果の一部は日本解剖学会総会、日本腎臓学会総会および東京大学におけるセミナーで発表した。
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