|
今回、腎臓におけるウロテンシンII(UII)の生理学的意義の詳細はを明らかにする目的で、腎動脈経由でU-IIのsiRNAを導入して内因性腎U-IIをgene silencingする実験を計画した。Gene silencingに有効なsiRNA配列を決定するためウロテンシンIIのcDNA配列をもとにTuschlらの推奨する配列デザイン法に基づき異なる塩基配列の2本鎖RNAを5つ化学合成し、リポゾーム-トランスフェリン法を用いてUIIの発現が確認されているラット大動脈内皮細胞に遺伝子導入し、real time RT-PCR法にてUIIのgene silencing効果を検討した。いずれのsiRNAもsilencing効果が10〜40%と不十分であった。蛍光ラベルしたオリゴプローブを同法にて導入したところ70〜80%の高効率で細胞内に導入されることが確認された。したがって化学合成siRNA効果が不十分な理由として1)UII mRNAの半減期が長いため一過性の遺伝子導入では効果が不十分な可能性、2)試した配列のデザインが悪く十分なsilencing効果が得れていない可能性、考えられた。1)の可能性を検討するためRNA polymerase III下にsiRNAを発現するレトロウイルスベクターを作成し安定形質導入を行うことで細胞内で恒常的にsiRNAが発現する系の検討、2)の可能性を克服するためリコンビナントDicerを用いたsiRNAライブラリーの検討を行っている。
また今回の研究に関連して、UIIの細胞増殖機構について解析し、UIIが酸化ストレスの存在下で、相乗的に細胞増殖促進作用を示すレドックス感受性増殖因子であることを明らかにした。
|
