| 研究概要 |
当初の実験計画に従い、CM Verfaillie等(Nature 418:41,2002)の方法を参考として、B6背景のGFPトランスジェニックマウス(GFPTg)の骨髄細胞をFibronectin coated plastic dish上で培養した。まず培養液交換頻度を検討したが、マウス骨髄細胞培養の場合、細胞播種後1-3日およびその後2-3日に1度の頻度の培養液交換によって浮遊細胞を除去しなければ、表面イムノグロブリン陽性のB細胞系列の集団が増加し、長期生存細胞がえられない事が明らかになった。
1/3日の培養液交換により、骨髄細胞から付着性細胞を3週間に渡って、肉眼観察上の増殖を維持しつつ培養可能となったので、培養液に10ng/mlのEGF, PDGF-BB, LIFを加えて培養を行ったところ、EGFあるいはPDGF-BBの添加により、観察上の増殖率は若干増加したが明らかな形態変化は認められなかった。LIF添加による明らかな形態・増殖性の変化は認められなかった。以後培養はEGF, PDGF, LIFを加えた条件で行った。
培養開始3週間後の細胞集団から長期培養可能なクローン樹立するため、MACS beadsを用いてCD45-/Ter119-の細胞集団を分離し、1-200cells/wellの条件で96well plateによる培養を行った。CD45,Ter119両陰性の細胞は約30-60%であったが、いずれの細胞密度の培養からも長期継代可能な小型細胞クローンは得られなかった。しかし、当初目標とした細胞とは形態的に異なるものの、長期継代可能な中型付着細胞が得られた。現在、得られた細胞の表面抗原解析、骨髄採取元のマウス系統や週令の違いによる影響を検討している。
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