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われわれがクーロニングしたアフリカツメガエルのRunx2をマウスRunx2アイソフォームと比較すると、構造的にはマウスII型とそのN端が類似する。しかし、3領域で相同性が低く、特にN端からDNA結合ドメインまでの領域は非常に低い。機能の違いを解析するため、それぞれのドメインをスワップさせた多数のキメラを作製した。作製したキメラコンストラクトを、オステオカルシン、[オステオポンチン、アルカリフォスファターゼのプロモーターをルシフェラーゼ遺伝子に組み込んだレポーター遺伝子とともにC2H10T1/2細胞に一過性に遺伝子導入した。そしてその転写活性化に及ぼす影響を検討することで哺乳類における進化ドメイン決定を試みた。さらに体長4cmのツメガエルの大腿骨遠位部を分離し、コラゲナーゼで処理した後、骨芽細胞を単離し希釈したL15培地で室温で培養し、ツメガエルbeta-グロブリンプロモーターを組み込んだキメラコンストラクトを一過性に遺伝子導入し、アルカリフォスファターゼ染色でその活性化ドメインの進化を確認した。
その結果、アフリカツメガエルのRunx2プロモーター遺伝子導入群はマウスのそれに比べ、マウス骨芽細胞マーカーの転写が抑制されており、哺乳類の進化に伴い、Runx2プロモーター部位のみならず転写を制御する遺伝子群も進化していることが示唆された。また、キメラコンストラクトをアフリカツメガエル骨芽細胞へ遺伝子導入したところ、同様にマウスRunx2プロモーターは骨芽細胞のALP産生を抑制し、両生類と哺乳類では分子進化に伴い、Runx2による骨芽細胞への分化が最適化されていることを示唆した。
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