MALD-TOF法によるTLRシグナル分子相互作用蛋白質の検索法の開発

2005 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 16659500
• 研究機関: 日本大学
• 研究代表者: 花澤 重正 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (60060258)
• 研究分担者: 中野 善夫 九州大学, 歯学研究院, 助教授 (80253459) ; 舛広 善和 日本大学, 大学院・総合科学研究科, 講師 (00336083)
• キーワード: TLR / MALD-TOF / 相互作用因子 / シグナル伝達 / 制御因子

研究概要

私達はMALD-TOF法によるTLRシグナル分子相互作用蛋白質の検索法を確立するために、ごく最近示されたSOCSがTLRシグナル分子であるIRAK-4やIRAK-1と相互作用するという知見をもとにHis-Tag融合hSOCS-3組み換えタンパク質を用い、MAD-TOF法をによるその検索法を確立することを試み。以下の結果を得た。
1.His-Tag融合hSOCS-3組み換えタンパク質をbaitとしたものと、His-Tagコントロールを、各々HeLa細胞細胞質抽出液と混和した後、精製したHis-Tag及びHis-Tag融合hSOCS-3結合タンパク質群をSDS-PAGE、二次元電気泳動により分離した。
2.His-Tag融合hSOCS-3組み換えタンパク質に特異的に結合すると見られるタンパク質スポットをMALDI-TOFMSによる質量分析によって同定した。その結果、13種類のタンパク質を同定できた。
3.同定した蛋白質の中で微小管形成中心プラス端集積因子EB1と細胞骨格構成分子であるactinβ(以下、ACTB)が細胞内で相互作用する可能性が高いことがわかった。
4.HEK293T細胞にFLAG-hSOCS-3を強制発現させ、FLAG抗体レジンで免疫沈降を行い、EB1抗体とACTB抗体でそれぞれ検出を行った。その結果、hSOCS-3と内因性発現レベルのEB1、ACTBは相互作用することが確認できた。
以上、私達はHis-Tag融合hSOCS-3組み換えタンパク質をbaitとし細胞質抽出物より、その結合蛋白質を精製し、その相互作用蛋白質を同定するためのMAD-TOF法を用いた検索法を確立することができた。この方法は歯周疾患病原細菌成分のTLRシグナル伝達系の分子の制御因子を探索する上で有効であると思える。

研究成果

• [雑誌論文] Adiponectin inhibits Toll-like receptor family-induced signaling. (2005)
  • 著者名/発表者名: Yamaguchi N.Argueta JG, Masuhiro Y, Kagishita M, Nonaka K, Saito T, Hanazawa S.Yamashita Y.
  • 雑誌名: FEBS Lett. 579・30 ページ: 6821-6826
• [雑誌論文] Identification and characteri-zation of novel isoforms of human DP-1 : DP-1{alpha} regulates the transcriptional activity of E2F1 as well as cell cycle progression in a dominant-negative manner. (2005)
  • 著者名/発表者名: Ishida H, Masuhiro Y, Fukushima A, Argueta J amaguchi N, Shiota S, Hanazawa S.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 280・26 ページ: 6821-6826
• [雑誌論文] Splicing potentiation by growth factor signals via estrogen receptor phosphorylation. (2005)
  • 著者名/発表者名: Masuhiro Y, Mezaki Y, Sakari M, Takeyama K, Yoshida T, Inoue K, Yanagisawa J, Hanazawa S, O'malley BW, Kato S.
  • 雑誌名: Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 102・23 ページ: 8126-8131
• [雑誌論文] Interleukin-6 negatively regulates Porphyromonas gingivalis fimbria-stimulated fibronectin expression in human gingival fibroblasts. (2005)
  • 著者名/発表者名: Murakami Y, Shoji M, Hirata A, Tanaka S, Hanazawa S, Fujisawa S.
  • 雑誌名: FEMS Immunol.Med.Microbiol. 43・2 ページ: 205-211
• [雑誌論文] Tumor necrosis factor alpha enhances Actinobacillus actinomycetemcomitans leukotoxin-induced HL-60 cell apoptosis by stimulating lymphocyte function-associated antigen 1 expression (2004)
  • 著者名/発表者名: Yamaguchi N, Kubo C, Masuhiro Y, Lally ET, Koga T, Hanazawa S.
  • 雑誌名: Infect.Immun. 72・1 ページ: 269-276