| 研究概要 |
本研究計画では,アフリカツメガエル胚未分化細胞再集合培養系を用いて以下の検討を行った.
アニマルキャップ(AC)をCa^<2+>,Mg^<2+>を含まないSteinberg's solution (SS)中で細胞解離後,activin A (25ng/ml)で1時間処理した細胞群とactivin A未処理群を種々の比率で混合し,Ca^<2+>,Mg^<2+>を含むSS中で再集合体を形成し培養後,組織学的解析、RT-PCR法およびin situ hybridization法にて各種遺伝子発現を検討した.また,再集合体を正常胚へ移植し,組織学的ならびに分子生物学的に解析した.
1.ActivinA処理細胞のみから形成した再集合体(Aat再集合体)は,培養期間7日では,組織学的にyork-richな内胚葉組織から構成され,内胚葉組織に発現するendoderminの発現を強く認めた.
2.Activin A処理群:未処理群1:1から形成した再集合体は,培養期間7日では,組織学的に主に脊索ならびに筋組織から構成され,Xnotおよび後方脊髄に発現するHoxb9の発現を強く認めた.
3.activin A処理群:未処理群1:5から形成した再集合体(1:5再集合体)は,培養期間7日では,組織学的に主に軟骨組織から構成され,顎顔面領域ならびに軟骨に発現するgsc, X-Hoxa2,X-dll4,Sox9,Col2の発現を認めた.in situ hybridization法の結果,培養期間4日目において,gsc, X-dll4,Sox9,Col2の遺伝子発現の局在を認めた.しかし,Hoxb9の発現は認めなかった.
4.1:5再集合体を正常胚(st23)下顎相当部へ移植を行ったところ,10日目組織は主に軟骨組織によって構成され,1日目,4日目の移植組織でgsc, X-Hoxa2,X-dll4,Sox9,Col2の発現をを認めた.
5.1:5再集合体を正常胚(st23)腹部へ移植を行ったところ,10日目の同組織には,軟骨組織,筋組織,神経組織,眼球様構造、並びに歯胚様構造を認めgsc, x-Hoxa2,X-dll4,Sox9,Col2の発現および歯胚様構造部にはアメロジェニン陽性所見を認めた.
6.1:5再集合体,下顎相当部移植組織,および腹部移植組織ではPax6の発現は認められなかったが,培養24時間の1:5再集合体,1日目ならびに3日目の腹部移植組織ではその発現を認めた.
以上の結果より,再集合培養系を用いてin vitroで未分化細胞から細胞分化ならびに位置情報をコントロールすることができた.
|
