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1)第五染色体上の複製タイミングの決定
申請者はマウス第5染色体E5-F bandの染色体領域間(約8Mb)のDNA複製期中の複製タイミングを、マウス培養細胞L929株でFluorescence in situ Hybridization(FISH)法により決定した。G bandであるE5 bandに位置する領域は複製タイミングが遅く、対してR bandに相当するF bandに位置する領域は早いタイミングで複製した。R band領域は2~3Mbごとの複製開始ドメインに分かれることが判った。レーザスキャニングサイトメータとFISH法を組み合わせた解析により、初代培養細胞(fibroblast)でも複製タイミングの分布がL929株と一致した。また、一つの初期複製ドメイン内での複製順序はランダムに起こることを示唆する結果を得た。
2)アレイの作成と複製開始点の同定
上記の8Mb領域のうち、特にE5 band(G band)とF band(R band)の境界を含む約1.2Mbの領域の約1Kb程度の断片を含む整列クローンおよびPCR産物からなるDNA arrayを作成した。S期の異なる時期に複製したDNAを回収・ラベルし、マイクロアレイ上に競合的にハイブリダイズさせ、時期特異的な複製産物の相対比を求めたところ、FISH法で得られた結果と同じくG bandとR bandの境界部分で明らかに複製タイミングの違いが観察された。
3)ヒト人工染色体上の複製開始点の同定
ヒト人工染色体はアルフォイド配列とベクターである酵母人工染色体(YAC)がタンデムに増幅した構造をとっている。DNA fiber法とFISHを組み合わせることで、人工染色体の中で使用される複製開始点の同定を試みた。複製開始点の同定までには至らなかったが、その過程で、ヒト人工染色体の構造解析を行い、人工染色体が増幅する過程についての知見を得た。
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