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交付申請書に記載した研究目的・研究実施計画に沿って研究を行い、下記の成果を得た。
これまでの研究において、rat-1細胞にグルコースを投与すると、時計遺伝子Per1及びBmal1の発現量が低下した後に概日リズムを示すこと、及び、転写抑制因子をコードするTieg1遺伝子の発現量が一過的に増加することを見出していた。そこで今年度は、Per1及びBmal1遺伝子の転写調節に対するTIEG1蛋白質の効果を解析した。TIEG1発現ベクターを作製すると共に、Per1及びBmal1の上流配列を単離してレポーターベクターを作製し、これらを用いてレポーター解析を行った。その結果、TIEG1は両レポーターの転写活性を用量依存的に抑制することが判明した。続いて、上流配列に変異を導入したレポーターを用いることにより、TIEG1が作用するシスエレメントを探索した。その結果、GC-box配列に変異を入れた場合にTIEG1の作用が消失することを見出した。さらに、ゲルシフトアッセイの解析結果からTIEG1が配列特異的にGC-boxに結合することが判明した。以上の結果から、TIEG1を介した時計遺伝子の転写調節機構が明らかとなった。さらに、マウスの肝臓におけるTieg1発現量の日内変化をRT-PCR法により解析した結果、昼と夜の境にピークを持つ日周リズムを示すことが判明し、TIEG1が生体内においても時計機構に関与する可能性が考えられた。これらの研究と並行して、Per1遺伝子の転写を抑制する時計蛋白質E4BP4の機能解析に着手した。E4BP4は生体内においてリン酸化され、これが時計の同調に重要な役割を果たすことが当研究室において見出されたため、リン酸化されたE4BP4を特異的に認識する抗体の作製を試みている。今後、E4BP4のリン酸化を介した機能調節機構を解析し、概日時計の同調機構に迫りたい。
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