| 研究概要 |
1.遺伝子の基礎解析
まず,Rhm54,Rhm52遺伝子について,cDNAのクローニングを行った.RT-PCRを用い,Rhm54,Rhm52のcDNAのクローニングに成功した.次に,各遺伝子のノーザン解析を行った.高温(37℃および42℃),紫外線照射(100J/m^2,200J/m^2),メチルメタンスルホン酸(0.1%,0.2%),メチルヴィオロゲン(0.1mM,1mM,10mM)のストレスを与えた菌体からRNAを抽出し,Rhm54,Rhm52遺伝子の発現をノーザン解析により調べた.その結果,各遺伝子は定常状態でも一定の発現が見られるが,各ストレスによって転写量が増大していることが確認された.特に,メチルヴィオロゲンによる転写の活性化が顕著であった.メチルヴィオロゲンは細胞中で活性酸素を発生する.いもち病菌が非親和性の宿主に感染を試みた際にも過敏感反応としてオキシダティブバーストが起こり,活性酸素が発生する.活性酸素ストレスにより組換え修復遺伝子の転写の活性化が起こる事は,本研究の仮説を支持するものである.
2.遺伝子破壊用ベクターの構築
Invitrogen社のGATEWAYシステムを応用した糸状菌遺伝子破壊用ベクターの構築を行った.通常,遺伝子破壊用ベクターは目的遺伝子の上流および下流のDNA断片と,その間に選択マーカー遺伝子を挿入する複雑な過程が必要である.今回,我々がデザインしたベクターは,Inverse PCRにより目的遺伝子断片を増幅し,Topo反応により導入し,しかる後にハイグロマイシン耐性ベクターに組換えによって導入するものである.これにより,簡便に遺伝子破壊が行えるようになった.
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