微生物由来D-立体特異的ペプチダーゼと擬似基質を用いたペプチド合成に関する研究

2004 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 16780059
• 研究機関: 富山県立大学
• 研究代表者: 米田 英伸 富山県立大学, 工学部, 講師 (50285160)
• キーワード: D-アミノ酸 / ペプチダーゼ / ペプチド合成

研究概要

Bacillus cereus由来のアルカリD-ペプチダーゼはフェニルアラニンのオリゴペプチドにD-立体選択的に作用するエンドペプチダーゼであり、その一次構造は細菌由来のβ-ラクタマーゼやD-立体選択的アミノペプチダーゼと相同性を有するユニークな酵素である。本研究ではラセミ体の光学分割やD-アミノ酸含有ペプチドの合成にしか利用されてこなかったD-立体選択的加水分解酵素の新たな活用法を開拓するため、Substrate mimeticsとよばれる擬似基質を用いたペプチド合成に本酵素を応用することを目的とした。
B. cereus由来のアルカリD-ペプチダーゼ遺伝子は申請者らにより既にクローニングされている。この遺伝子を組み込んだ発現プラスミドを作製し、大腸菌における大量発現を検討した。酵素精製を容易にするため、His-tag等との融合たんぱく質としての発現も検討した。次いで、各種クロマトグラフィーの手法及び、FPLC等を用いて組換え大腸菌からアルカリD-ペプチダーゼを単一に精製した。一方、ドイツ、マックスプランク研究所のフランク・ボルドゥサ博士らの協力を得て、酵素法によるペプチド合成のためのアシル供与体(擬似基質)及びアシル受容体を化学合成した。精製したアルカリD-ペプチダーゼを用いてペプチド合成を検討した。既に、アルカリD-ペプチダーゼ遺伝子近傍に発見しているアルカリD-ペプチダーゼ相同タンパク質遺伝子を組換え大腸菌にて発現させた。本相同タンパク質もペプチド合成に応用することを目的として、組換え大腸菌から酵素精製を行った。

研究成果

• [雑誌論文] S-Stereoselective piperazine-2-tert-butylcarboxamide hydrolase from Pseudomonas azotoformans IAM 1603 is a novel L-amino-acid amidase. (2004)
  • 著者名/発表者名: Komeda, H., Harada, H., Washika, S., Sakamoto, T., Ueda, M., Asano, Y.
  • 雑誌名: Eur.J.Biochem. 271 ページ: 1465-1475
• [雑誌論文] A novel R-stereoselective amidase from Pseudomonas sp. MCI3434 acting on piperazine-2-tert-butylcarboxamide. (2004)
  • 著者名/発表者名: Komeda, H., Harada, H., Washika, S., Sakamoto, T., Ueda, M., Asano, Y.
  • 雑誌名: Eur.J.Biochem. 271 ページ: 1580-1590
• [雑誌論文] Purification, characterization, gene cloning and nucleotide sequencing of D-stereospecific amino acid amidase from soil bacterium Delftia acidovorans
  • 著者名/発表者名: Hongpattarakere, T., Komeda, H., Asano, Y.
  • 雑誌名: J.Indust.Microbiol.Biotechnol. (in press)
• [雑誌論文] Asymmetric synthesis of L-α-methylcysteine with the amidase from Xanthobacter flavus NR303
  • 著者名/発表者名: Inone, A., Komeda, H., Asano, Y.
  • 雑誌名: Advanced Synthesis & Catalysis (in press)