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破傷風菌やジフテリア菌が産出する毒素は大小二つの球形のタンパク質複合体領域をつなげたひょうたん型である。大きな球の部分はラージドメイン(C断片、95kDa)と呼ばれるタンパク質複合領域であり、毒素を脳や脊髄等の中枢神経に運ぶ役割を果たしていると報告されている。しかし、ラージドメインだけでは毒素を運ぶことはできず、スモールドメインが必要となるが、同じ破傷風菌のスモールドメインと結合すると毒素となるため、使用できない。そこで、ジフテリア菌のスモールドメイン(B断片、37kDa)と破傷風菌のラージドメインを結合したものを作成することとした。
昨年度にクローニングを試みた物目的のタンパク質の発現を確認したところ、大腸菌でタンパク質として発現できなかったため、文献の再調査を行った。破傷風菌のラージドメインは破傷風菌毒素の遺伝子配列2873番目から4228番目が必要と判断し、破傷風菌からDNAを単離したものを鋳型とし、pQE30へクローニングしている。ジフテリア菌からは毒素のスモールドメインをコードする部分を文献から特定できなかったので、ジフテリア毒素の遺伝子配列1521番目から1980番目(長いバージョン)と1521番目から1810番目に12塩基配列を付加したもの(短いバージョン)をPCRで増幅を試みた。短いバージョンに12塩基配列を付加することで、4アミノ酸配列が増えるが、この配列がないと成熟タンパク質が得られないという報告が出ているので、配列を付加した。長いバージョンはPCRの条件をいろいろ検討しているが、未だに増幅する条件に至っていない。短いバージョンは最近になって、増幅できる条件を見つけることが出来た。
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