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1.スラバヤ地方における臨床、及び、環境分離株のPCRスクリーニングを行った。PCRによる毒素原性大腸菌(ETEC)以外の菌株の陽性反応のシグナルは弱く、シグナル強度は、再デザインされたプライマーを用いても改善されなかった。
2.PCR スクリーニングで陽性を示した菌株については、グラム陰性の桿菌でチトクローム・オキシダーゼ試験陽性であった。本菌株は、栄養最小限培地やLuria-Bertani brothでは、ETECなどの大腸菌と比較して著しく増殖が遅かった。そこで、他の種々の複合培地で培養を行ったところ、栄養豊富な複合培地では増殖速度の上昇が認められるが、これら条件で培養した菌株では、PCR反応による毒素遺伝子シグナルが陰性化する傾向にあることが判明した。
3.スラバヤ地方から分離されたETEC以外のPCR陽性株について菌体DNAを種々の制限酵素で消化し、パルスフィールド電気泳動を行った後、ゲル中のDNA断片をニトロセルロース膜に転写し、ETECの易熱性エンテロトキシン遺伝子に対するプローブに対してハイブリダイゼーションするバンドの検出を試みた。その結果、low stringency条件下で本プローブに反応するバンドが検出されることが判明したので、このハイブリダイゼーションシグナルを示すバンドをアガロースゲルから切り出し、クローニングべクターにライゲーション後、大腸菌コンピテントセルにトランスフォーメーションした。平板培地上に形成されるコロニーをピックアップし、PCR反応により易熱性エンテロトキシン類似遺伝子を含むクローンをスクリーニングした。PCR陽性反応を示すクローンをピックアップし、このクローン中のプラスミドの精製が完了した。
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