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C型肝炎ウイルス(HCV)の培養細胞での効率的な複製系が確立されていなかったため、HCVの複製の機構はあまりよく解析されていない。主に培養細胞に発現プラスミドでHCV非構造蛋白(NS蛋白)を発現させる実験でNS3からNS5が複合体を形成し小胞体膜に存在し、また、この複合体形成はHCVの複製に重要であると考えられている。しかし、このNS蛋白複合体のHCV複製に対する役割は直接的には証明されていない。本研究はHCVレプリコンの複製しているHuh7細胞を使ってNS蛋白複合体のHCV複製に果たす役割を明らかにする事を目的とする。現在までの研究でそれぞれのNS蛋白の相互作用部位、酵素活性部位及び小胞体膜への貫通部位が示唆されている。16年度はそれぞれのドメインを持たないような変異体をHCVレプリコンの複製しているHuh7細胞に導入してレプリコン複製に対する影響を検討するために変異体発現のためのプラスミドを作製した。HCV遺伝子のNS蛋白領域のオリゴDNAとHCV cDNAを用いてPCR法によりNS蛋白変異体をコードするDNAフラグメントを増幅した。このフラグメントをGFP(Green fluorescent protein)との融合蛋白として発現するベクターに組み込んだ。NS3についてはN末端3分の1のみを発現するものとN末端22アミノ酸を発現するコンストラクトを、NS4AについてはN末端の疎水性領域を欠く変異体を作製した。それぞれの変異体を発現するプラスミドをHCVレプリコンが複製するHuh7細胞にトランスフェクションした。それぞれの変異体の発現はGFPのフローサイトメーターと蛍光顕微鏡による観察、及び、NS3、NS4A、またはGFPに対する抗体を用いたウエスタンブロット法にて確認した。
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