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これまでの研究でAzgp1が体重を規定する候補遺伝子である可能性を報告してきた。Azgp1の機能解析を行なうために、トランスジェニックマウスを作製する。
発現ベクターを作製のためGateway BP反応(Invitrogen)により、pSPORT6-ZAGに挿入されたAzgp1 cDNAフラグメントをpDONER201ベクターにディレクショナルサブクローニングして、pENT-Azgp1を構築した。次に、マウスaP2遺伝子の5'側上流領域(5.4kb)をクローニングするための相同配列、ニワトリβアクチン遺伝子の5'UTR(第1エキソン-イントロン-第2エキソン)、Gateway Rfaフラグメント、ウサギβグロビン遺伝子の3'UTR(ポリA配列)の各エレメントがタンデムに連結したaP2-CO plasmidを構築した。その後、Red/ET反応により、マウスaP2遺伝子をコードするBACクローンからaP2-CO plasmidの相同配列領域に、aP2遺伝子の5'側上流領域(5.4kb)をクローニングして、pBS-aP2-DESTを構築した。最後にGateway LR反応により、pENT-Azgp1に挿入されたAzgp1 cDNAフラグメントをpBS-aP2-DESTにディレクショナルサブクローニングして、Azgp1発現ベクターであるpBS-aP2-Azgp1を構築した。
現在、シークエンス解析により、Azgp1 cDNAフラグメントが正確に発現ベクターに挿入されているところまでを確認した。今後、C57BL/6N系統マウス(日本チャールズリバー)に精製したDNAフラグメントをマイクロインジェクションしていく予定である。
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