|
本研究では、腸管におけるビタミンD受容体(VDR)遺伝子の発達段階特異的発現制御機構の解明を試みた。すでに我々は、ヒトVDR遺伝子のプロモーター解析により、腸管特異的エンハンサー領域を同定し、ホメオボックス遺伝子であるCdx-2がVDR遺伝子の小腸での発現に重要な働きをしていることを明らかにした。同定したヒトVDR遺伝子の腸管特異的エンハンサー配列を含む合成DNA断片およびコア配列に変異を導入した合成DNAをビオチン化し、離乳前(2週齢)、離乳後(3週齢)のラット小腸粘膜から抽出した核蛋白質と反応させ、アビジンビーズを用いてエンハンサー配列に結合する因子群の精製を行った。その際、変異プローブを用いて非特異的因子を除去した。得られた抽出タンパク質を用いてウエスタン解析を行った結果、離乳後小腸核タンパク抽出画分において腸管特異的転写因子Cdx-2を確認した。しかしながら、ラット小腸よりラットCdx-2 cDNAをクローニングし、発達段階におけるCdx-2 mRNA発現をノーザンブロット法により確認した結果、Cdx-2 mRNA発現は離乳期前後においては変動しなかった。また、早期離乳および高カルシウム食摂取ラット小腸においては、VDR、カルシウム結合蛋白(CaBP-9k)の発現は有意に変動したが、Cdx-2においては発現の変化は見られなかった。このことから、Cdx-2は離乳応答性転写因子群の一つであるが、その機能調節に関わる因子が存在する可能性が示唆された。そこで、離乳前後のラット小腸粘膜よりビオチン化DNAを用いて精製した核タンパク質画分をそれぞれ2次元電気泳動で分離し、銀染色法にて染色後、得られたスポットのパターンを2次元ゲル解析ソフトで解析した結果、複数の異なるスポットを得た。今後、プロテオーム解析による腸管特異的因子群の同定および、Cdx-2と相互作用する因子の解析を予定している。
|
