| 研究概要 |
本研究では効率的なPIG-A遺伝子の遺伝子導入法と遺伝子導入造血幹細胞の増殖法の確立を目指している。そのための方法として、G-CSFレセプター・エストロゲンレセプターキメラ遺伝子を含むレトロウイルスベクターにPIG-A遺伝子を組み込み、CD34^+GPI^-細胞へ導入を検討することとした。H16年度の研究は5段階に分かれており、下記の通り現在、研究を進行させている。
(1)PIG-A遺伝子組み込みレトロウイルスベクターの作製:現在、PIG-A cDNAのG-CSFレセプター・エストロゲンレセプターキメラ遺伝子(Hanazono, Y., et al., Gene Ther, 2002)を含むベクタープラスミドへの組み込みを行っている。
(2)JY5細胞およびBa/F3細胞へのPIG-A遺伝子導入:(1)の発現効果を確認のために使用するJY5細胞(PIG-A遺伝子異常によるGPI^-細胞株)とBa/F3細胞(Interleukin-3(IL-3)依存性細胞株)を調製している。
(3)CD34^+CD59^-細胞の分離およびPIG-A遺伝子導入:PNH症例の骨髄血単核球をCD34モノクローナル抗体(HPCA-2)、CD45モノクローナル抗体(Hle-1)およびCD59モノクローナル抗体の3種類の抗体用いた免疫染色およびその後に行うFA CS Vantage (Becton Dickinson)を用いたCD34^+CD59^-細胞を無菌的に採取法の確立を行っている。
(4)in vitroコロニーアッセイ:健常人およびPNH症例における基礎データの採取を行っている。PNH症例のGPI陰性CD34陽性細胞では健常人と同等もしくはそれ以上のコロニー形成が認められた。
(5)LTC-ICアッセイ:健常者由来の骨髄細胞からのstem cell media (Stem cell technologies)を用いたstroma細胞を調整中である。
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