|
細胞培養
家兎の関節軟骨を酵素処理して軟骨細胞を単離し、比較的低密度でシャーレに撒き24時間後に分析した。平成16年度の研究で軟骨細胞の形質がある程度保たれていることを確認していたが、平成17年度は以下の分析を前年よりも厳密に行って検証した。
1)細胞内Ca濃度の計測:Ca感受性蛍光色素Fura-2を培養液に加え蛍光の変化をビデオカメラに撮影した。これによって経時的変化を捉えることに成功した。
2)培養液にUTPを投与した後、培養液中のATPの濃度をルシフェリン/ルシフェラーゼで計測した。これもビデオカメラで経時的に観察したが、基準の取り方に更なる工夫が必要であった。
3)ATP放出の経路になっていると予想できるATP channelを検出すべくパッチクランプを行なった。しかし、明らかなATP channelをとらえることが出来なかった。試行回数を繰り返すとともに細胞調整の仕方も修正する必要があると考えた。
4)軟骨細胞に存在するATP受容体P_<2Y2>を阻害する20μM suraminを投与して観察したところ、Ca濃度の変化が伝播しないことが明らかになった。ただし、感度設定の仕方をさらに厳密にしなければ完全に阻害されているかどうかは断定できない。
組織培養
1)家兎の膝関節軟骨を0.2mm程度の薄片とし細胞内Ca濃度を観察した。共焦点顕微鏡で観察しながら、ATPおよびATP放出阻害試薬(Niflumic acidかDIDS)を加えた。前年度の観察においては細胞培養と同様の現象が起こると考察したが、詳細に観察すると基準光度の取り方で解釈に大きな違いが出ることが分かった。この違いは、検出精度のみによるものなのか、細胞と組織の違いによるものなのか、組織の切り出し方に起因するものなのか、という疑問に結論を下すにはさらに観察を続ける必要があった。
|
