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1.完全長Dax-1cDNAの作製:マウス胎仔精巣よりmRNAを抽出し、オリゴ(dT)プライマー、ランダムプライマーによって逆転写反応を行いcDNAを合成。5'、3'プライマーを作製した後、cDNAを鋳型にPCRを行いDax-1遺伝子の全長を増幅した。得られたcDNAをプラスミドベクターに組み込み、大腸菌にトランスフォーメーション。増やして回収後、挿入断片の一部をシークエンスした後配列情報と比較して一致するかを確認した。このプラスミドベクターをCV-1細胞にリポフェクション法により遺伝子導入したのち、ウエスタンブロッティングによりDax-1蛋白の過剰発現を確認した。セルトリ細胞株にても同様に確認した。
2.組み換えアデノウイルスの作製:COS-TPC法を利用した組換えアデノウィルス作製キットAdenovirus Expression Vector Kit (TaKaRa Code 6150)を用いて行った。コスミドベクターにDax-1遺伝子を含むプラスミドを挿入したのち構造を確認し大量調製を行った。組換えアデノウイルスを作製し、構造を確認したのち力価を測定した。ウイルス液は5%FCS及びペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEMを用い、10^9pfU/mlのウイルス液を10mlに調製した。作製したアデノウイルスベクターをCV-1に遺伝子導入しDax-1蛋白の過剰発現を1.と同様にウエスタンブロティングにより確認した。
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