| 研究概要 |
以前、クローニングした、γ-aminobutyraldehyde dehydrogenaseに加え、および群馬大学大学院医学系研究科遺伝発達行動学分野 柳川右千夫教授より、GAD67、GAD65、GAD67 exon0a,0bのcDNAを譲り受け、in situ hybridizationを行うための準備を行った。
各プローブの塩基数は、γ-aminobutyraldehyde dehydrogenaseが774bp、GAD67が580bp、GAD65が630bp、GAD67 exon0aが199bp、GAD67 exon0bが240bpとすることとした。これらはプラスミド・ベクター、pBluescript II KS(+)に組み込まれている。in situ hybridizationに使用するためにはこれらをpGEM 7-Zf(+)に組み込む直す必要があるため、制限酵素にて消化させ、ベクターへの組み替え作業を行った。
それぞれのプローブをcDNAを制限酵素で消化させ、目的の遺伝子が確実に含まれているかを電気泳動にて確認した。その結果、一部に目的遺伝子と異なるバンドが出現したため、再度組み換えおよびクローニングを行い、確認作業を行うこととした。しかし、クローニングの条件設定に難航し、十分なcDNAを得ることが難しく、多くの時間をこの作業に費やさざるを得なかった。結果的には十分な量の目的遺伝子が得られたため、再度、制限酵素による消化を行い、電気泳動にて目的とするバンドが得られたため、目的のcDNAが得られたと判断し、ジゴキシゲニン標識キットを用いてプローブの作成に移行した。
この実験の成功はプローブの善し悪しで決定される。プローブの作成には条件設定が必要であるが、温度設定に必要なウォーターバスがなかなか揃わず、無駄な時間を要してしまった。このため、現在、第1回目のプローブ作成を行ったところであり、今後、プローブの確認をメンブレンによる濃度勾配で確認する予定である。
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