| 研究概要 |
Amphiphysin Iはニューロンの軸索終末部でシナプス小胞膜のエンドサイトーシスに関与するタンパク質である.我々はヒト網膜cDNAライブラリーのクローニングや特異抗体を用いた生化学・免疫組織化学的解析から,網膜特異的に発現するamphiphysin Iバリアント(amphiphysin Ir)を見いだした.Amphiphysin Irには複数のオルタナティブスプライスフォームが存在するが,網膜リボンシナプス特異的に発現するタイプと,網膜色素上皮に特に強く発現するタイプに大別することができる.リボンシナプスは網膜の視覚情報の伝達過程に,一方の色素上皮は神経網膜の健常性の維持に不可欠であることから,amphiphysin Irが網膜視機能の発現・維持に何らかの重要な役割を担っている可能性が考えられる.初代培養法が確立され,また培養細胞も樹立されている色素上皮細胞を用いてRNAi法の開発を進めるとともに,色素上皮タイプのamphiphysin Irの機能解析を行い,以下の結果を得た.
1)Amphiphysin Ir遺伝子の発現抑制に有効と考えられるsiRNA標的配列の予想と培養細胞(HEK293)を用いた,最適なsiRNA標的配列のスクリーニング法の確立.
2)siRNA発現カセット配列をもつプラスミドベクターの作製と精製.
3)ラット網膜色素上皮を用いた初代培養の立ち上げと,ウエスタンブロットによる初代培養系でのamphiphysin Ir(色素上皮タイプ)発現の確認.
4)網膜色素上皮におけるamphiphysin Irの局在部位の免疫組織化学による同定.
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