| 研究概要 |
A, In vitro
cell lineから角膜上皮細胞、結膜細胞、網膜色素上皮細胞を選び24wellディッシュで培養を行った。EGFPプラスミドを培養液に添加したのち、ソニトロン2000(超音波照射装置)を使い、各種条件で超音波を照射した。48時間後に蛍光実体顕微鏡で、GFPの蛍光をもとに導入効果を判定した。
2w/cm^2,1w/cm^2(照射時間は60秒から120秒)の超音波エネルギーがもっとも効果的に遺伝子導入することが可能で、導入効率は約10%程度で、併せておこなったリポフェクション法とも同等もしくはそれ以上であった。細胞障害性についてLDHアッセイを用いて検討すると、2w/cm^2の条件では細胞障害が強く、安全性の面では1w/cm^2がもっとも効果的であった。
B,超音波とMBを併用
GFPプラスミド溶液にマイクロバブルoptionを10%,20%,50%,100%の濃度で混合し、上記の実験を行った。20%,50%,100%の濃度で約20から30%の導入効率を示し、マイクロバブルを併用することで導入効率は2から3倍に向上していた。(LDHアッセイの結果では、100%の濃度では細胞障害性が強かった。)
C, In vivo
白色家兎を用いA,Bで得られた超音波照射条件、マイクロバブルの条件をもと、兎組織に超音波(ソニトロン2000使用)をあて実験を行っている。EGFPプラスミドを用いた実験の結果、蛍光実体顕微鏡でGFP蛍光を確認できた。現在実験を進行中。今後超音波条件と導入効率についてさらに検討をすすめる。
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