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本研究は、歯髄組織に特異的かつ薬剤誘導性のコンディショナルノックアウトマウスを作成することを最終的な視野に入れ、導入すべきCre発現ベクターを構築することを目的としている。昨年度は、候補となる遺伝子のプロモーターについて検討を行った。すなわち、マウス歯髄組織において強い発現が認められたdentin sialophosphoprotein(DSPP)に着目した。本年度は以下の実験を行った。まず、歯髄細胞から象牙芽細胞への分化系(アスコルビン酸とβ-グリセロリン酸の共刺激による細胞培養系)を用いてDSPPの遺伝子発現をreverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR)法で検討したところ、分化マーカーの1つであるアルカリフォスファターゼと共にDSPPの発現が増強した。以上の知見から標的とする遺伝子をDSPPとした。次に、Cre発現ベクターであるpBS185をヒト歯髄細胞株(LSC)にトランスフェクションし、Cre遺伝子の発現をRT-PCR法で確認した後、pBS185ベクターのヒトサイトメガロウイルスのプロモーターをマウスDSPPのプロモーター(約2.6kbp)と置換した。その後、構築したベクターを1.マウス線維芽細胞(L929) 2.LSC細胞 3.ヒト皮膚線維芽細胞(SF-MA) 4.ヒト肺線維芽細胞(MRC-5)にトランスフェクションし、Cre遺伝子の発現をRT-PCR法によって解析したところ、すべての細胞において弱い発現が認められ、歯髄細胞における特異的な発現が認められないという結果を得た。現在、1.マウスDSPPのプロモーターで領域をより長い約5kbpまで延長させること 2.ヒト歯髄細胞株ではなく、マウスの歯髄細胞株あるいはラットの歯髄細胞株(RPC-C2A)を用いることによって細胞特異性に関する検討を行っている。
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