| 研究概要 |
本研究は骨細胞様細胞株MLO-Y4ヘフッ化物を添加し、骨のホメオスターシスに重要な役割を担っているGap Junctionタンパクconnexine43 (Cx43)の機能変化を解析するこで、特にsiRNAを用いCx43をノックダウンさせた際の、MLO-Y4の増殖および構造の変化を検索することを目的としている。
細胞培養にはType I collage-coated dishesにて、10%fetal bovine serumを含むα modified essential medium (αMEM)を用いた。フッ化物はNaFを用い、NaF濃度を0.1ppm,1ppm,10ppm,100ppmに調製し、細胞に添加した。Cx43のノックダウンの作製は、Ambion社のwebsiteより、siRNA sequenceをサーチし、pSilencerTM 4.1-CMV hygro vector (Ambion, USA)にライゲーションした。Cx43機能解析に用いたPhoto breaching法は、無処理細胞およびNaF処理細胞を、PBSで洗浄後、5-carboxy Fluorescein diacetate (7μg/ml) (Molecular Prosbe, USA)を添加し、30分間インキュベート後、多光子レーザー顕微鏡(BioRad, USA)により蛍光のリカバリーを検索した。
結果として、Photo breaching assayでは、NaF無処理細胞に比べ10 ppm NaF処理MLO-Y4で、すみやかな5-carboxy Fluorescein diacetateのリカバリーが認められた。Cx43 siRNAプラスミドはMLO-Y4にトランスフェクションし、hygromycin Bを用いてstable cell lineを現在作製中である。現在までの結果から、骨細胞はフッ化物存在下で細胞間ネットワークが促進されることが示唆された。
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