| 研究課題/領域番号 |
16H01775
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
益谷 央豪 名古屋大学, 環境医学研究所, 教授 (40241252)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 損傷乗り越えDNA複製 / DNAポリメラーゼ・イータ / PCNA / ユビキチン化 |
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| 研究実績の概要 |
ヒト細胞のゲノム安定性制御を理解することを目指して、ゲノム上にDNA損傷を残したままDNA複製の阻害を回避する損傷トレランス機構に着目し、初年度は以下の解析を行った。
I.ヒトDNAポリメラーゼ・イータとPCNAの相互作用による損傷乗り越え複製(TLS:translesion synthesis)の制御機構解明のために、イータの3つの特徴的なPCNA相互作用モチーフ(PIP)をコンセンサス型に改変した各種変異体を作出し、それらを発現させたヒト培養細胞株を作出した結果、一部の変異型を恒常的に発現させた細胞株は細胞増殖に異常をきたす可能性があることを明らかにした。一方、イータには、従来報告されている領域以外に、RAD18と相互作用する領域が存在することを見い出し、その同定を進めた。
II.HLTFによるPCNAのポリユビキチン化の分子機構を解明するために、無細胞系における反応機序の解析を進め、HLTFの活性化に寄与するDNA構造の探索を行った。一方で、ポリユビキチン化PCNAをもにユビキチン化PCNAに変換する活性を指標としてタンパク質を精製・同定した。そして、その遺伝子破壊細胞株を作出した。
III.PCNAホモ3量体の複数の分子が同時に翻訳後修飾を受けることにより活性化される未知の損傷トレランス機構を明らかにするために、PCNAのマルチ修飾を抑制した細胞株にDNA損傷を与えた後のDNA合成遅延、一本鎖DNAの露出、DNA鎖切断、チェックポイント機構の活性化を検出した。また、この機構に関与する因子のスクリーニングを実施した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
PIPを改変したDNAポリメラーゼ・イータを恒常的に発現させたヒト細胞株の樹立が困難な可能性を示唆する結果等の結果も得られたが、発現誘導系を用いた細胞株の樹立するなどの対応策により、おおむね予定通りに計画を進めることができている。
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| 今後の研究の推進方策 |
ヒトDNAポリメラーゼ・イータが持つ3つのPCNA相互作用領域の生理的異議については、改変型イータを恒常的に発現する細胞株に加えて、発現誘導系を用いた解析を併用することにより、その生理的意義を解析する。PCNAのポリユビキチン化機構については、初年度に明らかにしたHLTFのDNA要求性を、さらに詳細に明らかにしていくとともに、脱ユビキチン化経路との関連にも留意して解析を進めていく。加えて、PCNAのマルチ修飾の破壊細胞の解析を継続することにより、未同定のDNA損傷トレランス経路の解析を推し進める。
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