| 研究課題/領域番号 |
16H01881
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
裏出 良博 筑波大学, 国際統合睡眠医科学研究機構, 教授 (10201360)
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| 研究分担者 |
島本 茂 近畿大学, 理工学部, 講師 (00610487)
藤森 功 大阪薬科大学, 薬学部, 教授(移行) (70425453)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 睡眠 / 炎症 / 脂質メディエーター / 結晶構造解析 / 筋ジストロフィー / G蛋白質結合型受容体 / 酵素 |
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| 研究実績の概要 |
睡眠や炎症の調節に関与する脂溶性生理活性物質であるプロスタグランジン（PG)D2に関する研究を行なっている。PGD2の産生を司るリポカリン型と造血器型の2種類の合成酵素について、酵素・阻害剤複合体のNMR溶液構造とX線結晶構造に基いた新規阻害剤の開発や酵素反応機構の解析を進めている。国内製薬企業と共同開発した造血器型酵素阻害薬TAS205は、現在も治療法の無い難病であるデュシェンヌ型筋ジストロフィーの患者を対象とした探索的薬効評価試験が終了して、現在、解析作業が進んでいる。国際宇宙ステーションを利用した無重力環境でのヒト造血器型酵素とTAS205複合体の高品質結晶化実験を行い、大型放射光施設SPring-8での高分解能X線結晶回折データを収集して、最高分解能の構造座標の決定を進めている。この構造座標を利用して、TAS-205と同程度の薬効が期待できる阻害剤を理論的に安価に設計できる。細胞質に存在する造血器型酵素が、PGD2産生時には小胞体に移動し、膜蛋白質カベオリンと結合して本酵素の基質を産生するシクロオキシゲナーゼと共役する可能性を見出した。現在、その機能性複合体の証明を行なっている。PGD2受容体について、Gs共役型受容体のDP受容体とGi/Gq共役型受容体のCRTH2受容体の遺伝子欠損マウス(Balb/c系)を免疫して、マウスDP、マウスとヒトCRTH2それぞれに対するモノクローナル抗体を作製した。さらに、CRISPER/Cas-９遺伝子編集法を用いて、 DP受容体のN末端にFlag-tagを挿入したTGマウスと、同C末端側にIRES-EGFPを挿入したTGマウスを作製した。これらモノクローナル抗体と、TGマウスでのFlag抗体染色や蛍光蛋白質の発現解析により両受容体の細胞局在の解析を進めている。動物睡眠測定系を用いて様々な睡眠成分を見出し、一部は商品化された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度も国際宇宙ステーションを利用した無重力環境でのヒト造血器型酵素とTAS205複合体の高品質結晶化実験を行い、SPring-8大型放射光施設での高分解能X線結晶回折データの収集を終了して、現在、最高分解能での構造座標の精密化作業を進めている。さらに本酵素の水素原子の座標決定のために中性子線結晶構造解析プロジェクトを米国の研究者と開始した。本酵素とカベオリンとの結合にはカベオリンのスカフォールド・ドメイン内の10数残基の配列が重要であることを突き止めた。本配列は疎水性が高く非特異的結合が高いので親水性配列との融合ペプチドを用いた実験を継続している。リポカリン型酵素が基質(PGH2)や生成物(PGD2)以外にも様々なPG類をリガンドとして結合することを、示差熱的定法により証明した。現在、解離定数や化学量論的な解析を進め、結果をまとめている。PGD2の情報伝達を担うDP受容体とCRTH2受容体の細胞分布を知ることは、PGD2の生理・病理機能の理解に不可欠だが、各受容体に特異的な抗体がない。そこで、各受容体の遺伝子欠損マウス(Balb/c系)を免疫して、マウスDP、マウスCRTH2、ヒトCRTH2それぞれに対するモノクローナル抗体を作製した。特に、マウスCRTH2に対する抗体は、当該受容体の細胞外ループを認識し、同受容体に対するアンタゴニスト活性を示した。CRISPER/Cas-９法を用いて、 DP受容体のN末端にFlag-tagを挿入したTGマウスと、C末端側にIRES-EGFPを挿入したTGマウスを作製した。これらのマウスを用いたFlag抗体染色と蛍光蛋白質の発現解析を開始した。
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| 今後の研究の推進方策 |
筑波大学での研究を終了して、次年度より東京大学医学部附属病院と北里大学薬学部において研究を継続する。国際統合睡眠医科学研究機構での睡眠研究への集中から、炎症分野での研究を拡大して加速する。
国際宇宙ステーションでの高品質結晶化実験も次年度の継続が内定している。最終年度中に最高分解能のH型酵素・阻害剤の複合体構造の決定を終了する。さらに。中性子線結晶構造解析に向けた大型結晶の作製法や重水素置換体酵素発現法の開発の共同研究を開始した。
デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療薬として、H型酵素阻害と同じ薬効が期待できるDP受容体拮抗薬やCRTH2受容体拮抗薬について、モデル動物（mdxマウス）を用いた投与実験の準備を進めている。上記試薬について開発企業からの提供の内諾を得ている。準備が整い次第実験を開始する。
最終年度での目標達成に向け分担研究者の再編を行い、本研究課題をさらに推進する。
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