研究課題
糖鎖は、免疫機構に深く関与している。本研究は、糖鎖が免疫制御に働く機構の一端を明らかにするとともに、その機構を利用した免疫制御法を開発することを目的としている。申請者は、細菌由来自然免疫刺激糖鎖の構造と生物機能を解析し、それらが免疫活性化とそれに伴った免疫抑制を引き起こすことを明らかにした。その制御が容易ではないことから、主に生体由来の糖鎖を利用した新たな免疫調節法を考案するに到った。特にコアフコース等のN-グリカンの糖鎖修飾による免疫調節機能に焦点をあて、コアフコース認識レクチンの探索、コアフコース転移酵素阻害剤の開発、それらの免疫調節への利用について検討し、自然免疫調節剤の併用を含め、新たながん免疫療法に結びつけることを目的とする。本年度はまず，N-グリカンライブラリの構築を行った．コアフコース、バイセクティンググルコサミン、ポリラクトサミン、末端ガラクトースおよび末端シアル酸の機能を調べるために、糖鎖ライブラリを合成した。その結果，昨年度までにコアフコース含有糖鎖，バイセクティンググルコサミン含有糖鎖，ポリラクトサミン含有糖鎖の合成を達成した．また，合成した糖鎖を用いたレクチンとの相互作用解析も行った．シアル酸含有糖鎖とシグレックの相互作用をSTD-NMRにより解析した．また，コアフコースを認識するレクチン候補を発見し，SPR，STD-NMRなどによりその相互作用を解析した．さらに，コアフコースの機能制御を目指してコアフコースの生合成酵素であるFUT8の阻害剤の開発も行い，細胞系においても機能する阻害剤を得た．加えて，生細胞上での糖鎖が膜タンパク質の動態に及ぼす影響を調べるために，HaloTagテクノロジーを用いて合成N-グリカンを細胞表面に提示するシステムを構築法した。これを用いて種々の合成糖鎖で修飾した膜タンパク質が相互作用する分子の解析やそれが引き起こす動態変化を解析している．
2: おおむね順調に進展している
本研究では，コアフコースなどN-グリカンの構造修飾による免疫制御機構の解明を目指し、N-グリカンとレクチンとの相互作用を解析する。均一構造のN-グリカンを有する糖タンパク質モデルの構築法を確立し、蛍光イメージングによりを動態解析し、N-グリカンとレクチンのネットワークにより免疫関連受容体の動態と機能が制御されるという仮説を検証する。コアフコース転移酵素FUT8の阻害剤を開発し、転移酵素阻害剤を用いた生体内の糖鎖構造の制御による免疫調節という前例の無い課題に挑む。レクチンリガンドとなるN-グリカン、FUT8阻害剤、自然免疫受容体、自然抗体リガンドとそれらの組み合わせを用いた免疫制御について検討し、新規な免疫制御法と、さらにはそれを応用したがんワクチン療法を開発する。本年度はその基盤となるN-グリカンの合成において進展があった．昨年度までに合成したコアフコース含有糖鎖，バイセクティンググルコサミン含有糖鎖，ポリラクトサミン含有糖鎖の合成を基盤として，多分岐N-グリカンをより効率的に構築する多様性指向型の合成ルートを構築しつつある．本研究において，糖鎖合成が最も時間，労力がかかる過程であるが，この部分において大きく進展した．また，コアフコース認識レクチンの候補を発見した．発見したレクチンとコアフコース含有糖鎖との親和性をSPR，STD-NMRなどにより解析した．また，STD-NMRを用いたシグレックとの相互作用解析も行った．生細胞上での糖鎖が膜タンパク質の動態に及ぼす影響を調べるための実験に関しても，HaloTag融合GPRアンカータンパク質を発現する細胞を調製し，N-グリカンを細胞表面に提示するシステムを構築し，提示したN-グリカンガレクチンにより認識されることを確認した．今後N-グリカンの機能を調べる基盤の構築に成功したと考えている．
(i) N-グリカンライブラリの構築：現在開発中の多様性指向型合成ルートの構築を急ぎ，これを用いて，多様なN-グリカンの効率的合成を行う．特にシアル酸やポリラクトサミンを含有する糖鎖の合成に注力する．なお，ポリラクトサミン鎖含有糖鎖は化学合成による糖鎖骨格の構築後に酵素合成を用いて糖鎖の伸張を行う予定で，その方法論は確立しており，本年は多数の糖鎖を実際に合成する．(ii) 分子レベルでの糖鎖とレクチンの相互作用解析：合成した糖鎖を用いて，シグレック，ガレクチンと糖鎖の相互作用をSTD-NMRにより解析する．SPRによる親和性の測定も行う．また，これまでに発見したコアフコースを認識するレクチン候補と糖鎖の相互採用解析も引き続き行う．さらに，新たな糖鎖認識レクチンについても探索する予定である．(iii) 細胞レベルでの糖鎖修飾膜タンパク質の動態解析：HaloTagテクノロジーにより合成N-グリカンを細胞表面に提示し，糖鎖が膜タンパク質の動態に及ぼす影響を精査する。種々の糖鎖で修飾した膜タンパク質を調製し、それらについて一分子蛍光観察をはじめとした種々の蛍光イメージングにより解析する。ポリラクトサミンやコアフコースがエンドサイトーシスを抑えると報告されているので、これらの現象の再現を含め、詳細な動態解析を実施する。(iv) in vivo で利用可能なFut8 阻害剤の開発：Fut8 阻害剤の探索について、33,000 個の化合物ライブラリを用いたHigh-throughput screening を実施し、FUT8 阻害剤のファーマコフォアを発見した。現在、構造最適化を進めており、IC50 が数μMの化合物を見出している。一方で，このFUT8阻害剤は安定性や膜透過性に課題があることも分かってきた．そこでプロドラッグ化を検討し，細胞，in vivoで利用可能な阻害剤の開発を目指す．
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すべて 国際共同研究 (2件) 雑誌論文 (17件) (うち国際共著 9件、 査読あり 17件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (50件) (うち国際学会 28件、 招待講演 6件)
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