| 研究課題/領域番号 |
16H02282
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| 研究機関 | 大分大学 |
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研究代表者 |
一二三 恵美 大分大学, 全学研究推進機構, 教授 (90254606)
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| 研究分担者 |
加藤 龍一 大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構, 物質構造科学研究所, 准教授 (50240833)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 抗体酵素 / X線結晶構造解析 / 抗体 / 酵素反応 / 酵素活性 |
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| 研究実績の概要 |
今年度は本プロジェクトの初年度で有り、計画書に述べた様に、InfA-15抗体（インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（HA）に対するマウス型モノクローナル抗体）の構造決定を目的として、大腸菌を用いた大量発現と高純度精製、結晶化の検討から着手した。InfA-15抗体の軽鎖(InfA-15L)の発現では、第一段階のNi-NTAクロマトでは目標通り上手く精製と大量取得できた。しかしながら、第二段階の陽イオンクロマトではピーク分離が悪く通常法では無理と判断した。そこで219番目のシステインをアラニンに置換した変異体を作成し(InfA-15L_C219A)、精製方法の検討を行った結果、単量体として純品を精製する方法を確立することができた。その標品を大量に準備し、ターゲットとなるペプチド(GMVDGWYG)を合成して、InfA-15L_C219Aと混合後、結晶化ロボットを用いて1サンプルあたり約1,000種類の条件での初期結晶化スクリーニングを実施したところ、結晶を得る事ができた。現在、X線回折実験に取り組んでいる。
これと並行して、抗原ペプチドの用意が可能な別の抗体酵素クローンついても、結晶化を行うための実験に取り組んでいる。100数十種類のヒト型抗体酵素候補クローンについて標的となる複数の抗原（あるいは基質）を分解するかのスクリーニングを行った結果、これらを分解する（核酸分解活性やペプチダーゼ活性を有すると思われる）有望クローン数種類を見出した。現在、これらクローンのcharacterizationと付加していた、His-tagを外して結晶化をしやすくするサンプルの合成、さらには、その化学的あるいは生化学的性質の解析に取り組んでいる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究課題と並行して進めている「抗体酵素クローンの精製方法と構造多様性に関する検討」から、抗体タンパクには構造多様性があり、本研究で取り扱っている抗体酵素も例外ではないことが明らかになってきた。本研究で最初に取り扱うInfA-15抗体についても、ScFvの発現と精製を試みたが、代表者らが取り扱ってきた軽鎖タンパクよりも取り扱いは困難でることが分かった。そこで、大量発現と精製、構造均一化についてノウハウのある軽鎖タンパクの結晶化より着手することとし、これについては、InfA-15抗体軽鎖変異体に抗原ペプチドを取り込ませることで結晶化の目処が立った。
本クローンについて、他の形態（重鎖やScFvなど）での大量・高純度精製を進めることは出来なかったが、InfA-15抗体に導入する酵素活性サイトの構造決定に向けた検討は、前倒しで進めることが出来た。ペプチドや核酸・合成基質を用いる新たなスクリーニングにより、構造決定に有用と思われる複数のクローンを見出すことが出来た。結晶化のためのtagの取り外しなどを計画的に進めており、研究テーマ全体としては「おおむね順調に進展している」と判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
（１）上述したようにInfA-15L_C219Aについては、発現、大量取得、高純度精製、結晶化と上手く進んでいる。H29年度はInfA-15L_C219Aについて、沈殿剤の種類や濃度の検討だけでなく、その他に添加剤を加える等を試みて結晶化条件の検索を進め、立体構造決定が可能な良質な回折データセットの収集を目指す。また、ペプチドを含まない状態での結晶化についても検討を開始し、基質認識の前後でどのような変化があるか、ないか、についての知見が得られるようにする。
（２）H28年度に新たに見出した複数の高活性な抗体酵素について、大腸菌などでの大量発現、高純度精製、結晶化、構造解析と取り組む。これにより、抗体酵素のどの位置にどのアミノ酸が存在すれば、強い酵素活性を持ち得るかの解明に繋げる。尚、この実験ではそれぞれの抗原が必要であるが、価格が高く、購入金額が高額になるので、ペプチド合成や遺伝子工学的手法で、安定的に抗原を使える準備をして行く予定である。
（３）上述した1)の知見を基に、InfA-15抗体（whole抗体or scFv）の合成を行って、結晶化を目指し、抗原ペプチドの認識に関与する抗体側のアミノ酸を決定する。
（４）新しく見出した高活性な複数のクローンはInfA-15抗体とは異なり感染症に関連する標的ではなく、認知症や癌に関連した抗原を分解する。そこで、H29年度にはこれらの抗体酵素クローンについて、生化学的あるいは免疫化学的評価ができるアッセイ系を立ち上げ、これら活性と抗体酵素との活性サイトとの関連性の解明へ向けて実験を進めて行く。
（５）本プロジェクトのより効果的な計画実現に向けて、参加メンバー間のコミニュケーションをさらに高めて行く。このために電子データの交換はもとより、データ内容を詳細に検討するために相互訪問を必要に応じて直ちに行い、濃度の高い議論を進めて行く。
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