| 研究課題/領域番号 |
16H02485
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| 研究機関 | 奈良先端科学技術大学院大学 |
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研究代表者 |
森 浩禎 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 教授 (90182203)
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| 研究分担者 |
田村 武幸 京都大学, 化学研究所, 助教 (00437261)
川野 光興 新潟薬科大学, 応用生命科学部, 助教 (00455338)
松野 浩嗣 山口大学, 創成科学研究科, 教授 (10181744)
山田 守 山口大学, 創成科学研究科, 教授 (30174741)
大橋 菜摘 (斎藤菜摘) 鶴岡工業高等専門学校, その他部局等, 准教授 (50287546)
牧 泰史 大阪医科大学, 医学部, 講師 (60401733)
片岡 正和 信州大学, 学術研究院工学系, 准教授 (90332676)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 大腸菌 / 相互作用ネットワーク / 長期定常期 / 細胞生育 / 細胞死 / lag |
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| 研究実績の概要 |
大腸菌K-12株のリソース群を活用し、種間相互作用による相互作用ネットワーク解析手法の確立と解析を進める。
1)各成育期の細胞内外の物質及び状態の定量解析： 細胞生育時の物理的・化学的定量方法の確立を進め、特にin vivoでの細胞内pHの変動解析を可能にした。C、N及びP源枯渇による細胞死、再生育開始までの時間変動、細胞寿命の変化の解析から、一部の分子機構解明への糸口を掴んだ。
2)Chemical genomics解析、異種間競合、宿主腸内環境での解析に向けたBar-code欠失株ライブラリーによる混合培養解析手法の確立と解析： 全遺伝子欠失株混合培養によるpopulation変動をbarcode 欠失株を利用して、長期定常期でのpopulation変動、特定の薬剤に対する耐性機構解析、200種類を超える薬剤に対する網羅的な遺伝子相互作用解析を平行して解析を進めた。それぞれの解析でのデータ取得は終えることができ、一部は論文発表を行った。
宿主腸内環境に向けてbarcode欠失株にStreptomycin耐性を付加する方法を検討し、ribosomeの変異による耐性付与のための株を作製した。これにより、接合を用いて高効率に薬剤耐性の付与を可能にした。
3)モデル化： 局所モデルとグローバルモデルとの統合化は、国際共同研究グループと共に構築し（Kierzek, A., Surrey大学）、その成果は論文発表を行った。遺伝型と細胞生育を、遺伝子発現量、代謝物量など、定量測定結果をニューラルネットやディープラーニングなどの情報学手法によるグローバル及び局所モデル構築を進めており、アルゴリズムの検討はすでに論文として発表した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
研究開始当初の目標は、細胞内のpH、代謝基質濃度等の変動をrealtimeに測定する方法の確立を行い、細胞集団の、長期定常期、薬剤・化学物質ストレス等、環境変動に対する応答に対する細胞内遺伝子機能ネットワークに迫ることであった。これに対し、pH測定を含め、in vivoで蛍光タンパク質を利用したrealtimeの変動測定も可能になり、予想以上の進捗を見せた。構築した一遺伝子Bar-code欠失株ライブラリー混合培養による、混合培養中の各遺伝子欠失のpopulation中の変動を、bar-codeの頻度をシーケンサーで定量することで解析を進める方法論も、確立することができ、3週間の長期定常状態を維持した環境中での各欠失株のpopulation中の変動を定量化することができた。また、同欠失株混合培養液を用いて、薬剤に対する各遺伝子欠失の混合培養中のpopulation変動への影響を解析することで、薬剤に対する各遺伝子欠失の影響の解析を可能にした。最初の例として、細胞への毒性を示すTelluriteの毒性機構の解明と、自然界からの化合物を含んだ200種を超える化合物の各遺伝子欠失株の集団中での生育の影響を行い、すでにTelluriteに関しては論文化も行うことができ、想定以上の進捗を示すことができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
一遺伝子Bar-code欠失株ライブラリーの混合培養中の各欠失株の変動の定量化において、その実用性を示すことができた。まずは、大腸菌本来の生育環境である腸内環境においての解析手法の確立を行う。そのためには、Bar-code欠失株の持つChloramphenicol耐性に対して、宿主個体の腸内環境の清浄化のため、Streptomycin耐性を付与する必要がある。すでに2016年度に、リボソームタンパク質(rpsL)の変異によるStreptomycin耐性を、Hfr化した大腸菌株に移した。これにより、接合を用いて、全Bar-code欠失株に対して、薬剤耐性を写す準備は整ったので、実際に耐性遺伝子を移動させ、生体内での大腸菌の各遺伝子の生育への影響をbar-code解析を用いた解析手法の確立を行い、解析を進める。現在は、アメリカOklahoma州立大学のProf. Conway及び台湾国立成功大学のDr. Wangのグループと共同でin vivo 解析を進める予定でいる。
細胞機能のモデル化と実験サイドとの連携、環境の違いによる定常期、再生育、生育開始遅延、対数増殖と言った細胞生育の基礎解析は徹底して進める。
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| 備考 |
現在、不正アクセスのため、閉鎖中。可能な限り早く立ち上げたいが、技術的補助が必要な状況となっている。
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