| 研究課題/領域番号 |
16H02499
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
豊島 近 東京大学, 定量生命科学研究所, 教授 (70172210)
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| 研究分担者 |
小川 治夫 東京大学, 定量生命科学研究所, 准教授 (40292726)
金井 隆太 東京大学, 定量生命科学研究所, 助教 (50598472)
椛島 佳樹 東京大学, 定量生命科学研究所, 助教 (00580573)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 構造生物学 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、近年、多数の関連した疾病が認識されるようになり広範な注目を集めているP型ATPase（ポンプ）による能動輸送機構を原子構造に基づいて解明し、究極的には「何故そういう構造が必要なのか」を理解することを目指している。
最も研究が進んでいる筋小胞体Ca2+ポンプ（SERCA）に関しては反応サイクル全体をほぼカバーする10状態の結晶構造を決定できたが「2個のCa2+の結合による燐酸化反応の活性化シグナルとは何か」という重要な問題は未解決のままであった。本年度は、この問題に対し重要な手掛かりを与える、Ca2+が1個だけ結合した状態（E1・1Ca2+)の予備的結晶が得られたので、その構造決定と出発点となるE1・Mg2+状態の結晶の高分解能化を目指した。条件検討の結果、格段に精密化された原子モデルを得ることに成功した。さらに、Ca2+がポンプ蛋白質に結合する際のゲートとなるGlu残基のGln変異体の構造決定に成功した結果、予想外に大きな構造変化が認められ、研究期間を延長して構造の精密化とその詳細な解析を行った。
ナトリウムポンプに関しては、昨年度に続き、ポンプをチャネルに変えてしまう毒物パリトキシンとの複合体の構造決定を目指した。まだ低分解能ではあるが、パリトキシン結合による大きな構造変化が認められ、パリトキシン由来の電子密度も観察された。また、E1・3Na+状態と予想される予備的結晶が得られたので、結晶化条件の改良を行った。
P型ATPaseの一部は燐脂質を脂質二重膜の反対側へフリップする。ヒト由来の二つの複合体について、アデノウィルス-哺乳類培養細胞を用いた大量生産系の構築を行い、大量生産を開始した。本年度は大量生産条件の最適化を行い、特に、培養細胞の検討を行なった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
得られた結晶構造中に見えない部分があり、結晶化条件の検討に時間を要した結果、半年の延長を申請したが、期待を上回る結果が得られた。E2からE1状態への遷移ではプロトンが放出されるが、その意義が理解できるようになったことは大きな進歩である。
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| 今後の研究の推進方策 |
カルシウムポンプに関する一番の課題は「2個のCa2+の結合による燐酸化反応の活性化シグナルとは何か」であり、E1・1Ca2+状態の結晶構造のさらなる精密化を図る。ナトリウムポンプに関しては、特にE1・3Na+状態の構造決定を推進する。パリトキシンとの複合体に関しては、重原子探索を行い、低角の位相付けを推進する。flippaseに関しては、いよいよ結晶化を試みる。
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