| 研究課題/領域番号 |
16H02532
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| 研究機関 | 横浜市立大学 |
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研究代表者 |
辻 寛之 横浜市立大学, 木原生物学研究所, 准教授 (40437512)
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| 研究分担者 |
田岡 健一郎 横浜市立大学, 木原生物学研究所, 特任助教 (00467698)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | フロリゲン / メリステム / イネ |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、フロリゲン活性化複合体の機能を明らかにするためにイメージングと生化学的手法の両面から研究を進めている。まずフロリゲン活性化複合体の極めて高精細な分布を明らかにするために超解像度イメージングを試みた。しかしHd3aプロモーターでHd3a-GFPを発現するイネでは発現量が弱いため高感度な観察が困難である場合が多かった。そこで、維管束特異的で強力なプロモーターでHd3a-GFPを発現するイネを作成し、その茎頂メリステムを観察する実験系を作出した。また、一分子イメージングに適したmNeonGreenとフロリゲンHd3aの融合タンパク質を発現するイネを作成している。並行して、フロリゲンによる核内の状態変化を観察するために、H2B-GFP発現系統の茎頂メリステムの核内の超解像度観察を行った。その結果、H2B-GFPは核内でも核膜周辺に集まる蛍光があり、細胞層依存的に特徴的な核内微小構造を形成することが明らかとなった。
フロリゲン相互作用因子の同定のために、イネ培養細胞へのFAC発現ベクター導入と共免疫沈降実験のための条件設定を行った。また、転写メディエーターがフロリゲン直接相互作用因子である可能性を酵母２ハイブリッド法で検証した。シロイヌナズナの２８種の構成因子のうち、クローニングできた１３種（うち３つは遺伝学的に花成に関与することが知られている）について、Hd3aとの相互作用を調べた。しかし、有意な結合は観察されなかった。
また、フロリゲン活性化複合体の重要な構成因子であるフロリゲン受容体14-3-3タンパク質についても解析を行った。茎頂メリステムのプロテオーム解析から14-3-3タンパク質が茎頂メリステムに高蓄積していることが明らかになり、またその機能欠損が花成遅延を引き起こすことが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
超解像度イメージングはHd3aプロモーターでHd3a-GFPを発現するイネにおけるHd3a-GFPの蓄積量が超解像度イメージングするにはまだ足りないため、Hd3a-GFPの発現量を増強したイネや一分子イメージングに適した新規蛍光タンパク質とHd3aとの融合タンパク質を発現するイネの開発を行った。
フロリゲンによる核内の状態変化を観察するために、H2B-GFP発現系統の茎頂メリステムの核内の超解像度観察を行った。その結果、H2B-GFPは核内でも核膜周辺に集まる蛍光があり、さらに細胞層依存的に特徴的な核内微小構造を形成することが明らかとなった。
また、フロリゲン活性化複合体の重要な構成因子であるフロリゲン受容体14-3-3タンパク質についても解析を行った。茎頂メリステムのプロテオーム解析から14-3-3タンパク質が茎頂メリステムに高蓄積していることが明らかになり、またその機能欠損が花成遅延を引き起こすことが明らかとなった。
フロリゲン相互作用因子の同定のために、イネ培養細胞へのFAC発現ベクター導入と共免疫沈降実験のための条件設定を行った。また、過去の予備実験から転写メディエーターの構成因子のひとつがフロリゲン直接相互作用因子の候補として得られていたため、転写メディエーターが目的の相互作用因子のひとつである可能性を酵母２ハイブリッド法で検証した。シロイヌナズナの２８種の構成因子のうち、クローニングできた１３種（うち３つは遺伝学的に花成に関与することが知られている）について、Hd3aとの相互作用を調べた。しかし、有意な結合は観察されなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
超解像度イメージングはHd3aプロモーターでHd3a-GFPを発現するイネにおけるHd3a-GFPの蓄積量が超解像度イメージングするにはまだ足りないため、Hd3a-GFPの発現量を増強したイネや一分子イメージングに適した新規蛍光タンパク質とHd3aとの融合タンパク質を発現するイネの開発を行った。これらの観察を進める。
イネ培養細胞へのFAC発現ベクター導入と共免疫沈降実験のための条件設定を行ない、相互作用因子を質量分析で同定する。FAC発現ベクター導入効率と導入細胞のFAC応答性が鍵であるが、イネ培養細胞が最良の材料であるかは不明である。そのため、イネ培養細胞以外の植物細胞の利用も検討し、共免疫沈降の効率の向上を図る。転写メディエーターがフロリゲン直接相互作用因子である可能性を検証するために、未解析の１５種の因子についてクローニングを行い、Hd3aとの相互作用を調べる。
また、フロリゲン活性化複合体の重要な構成因子であるフロリゲン受容体14-3-3タンパク質については、共免疫沈降と質量分析による相互作用因子の特定を進める。
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