| 研究課題/領域番号 |
16H02544
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| 研究機関 | 静岡大学 |
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研究代表者 |
朴 龍洙 静岡大学, グリーン科学技術研究所, 教授 (90238246)
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| 研究分担者 |
加藤 竜也 静岡大学, 農学部, 准教授 (00397366)
宮崎 剛亜 静岡大学, グリーン科学技術研究所, 助教 (30775721)
池 和憲 日本獣医生命科学大学, 獣医学部, 教授 (50159597)
Deo VipinKumar 静岡大学, 国際連携推進機構, 助教 (80569806)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | バイオテクノロジー / ウイルス様粒子 / カイコ / ワクチン / 昆虫 |
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| 研究実績の概要 |
前年度の研究に続き、本年度は、下記の三つの研究を遂行した。
1）高免疫応答型多価VLPの作製： 前年度精製した多価VLPに、免疫賦活抗原としてN. caninum由来profilinを用い、そのC末端側にBmGP64の膜貫通領域を融合させた融合タンパク質（NcProf-GP64TM）を作製しカイコ幼虫で発現を行った。精製したNcProf-GP64TMは、受容体であるマウスTLR11との結合をELISAで確認したNcProf-GP64TMの形態を透過型電子顕微鏡で確認したところ、約10 nmの粒子であった。さらにProfilinタンパク質をニワトリ肉腫ウイルス（Rous sarcoma virus, RSV）由来Gagタンパク質からなるウイルス様粒子（RS-VLP）に提示を行い、免疫誘導の可能性を確認する予定である。
2）高免疫応答型多価VLPの精製：ニワトリ肉腫ウイルス（Rous sarcoma virus, RSV）由来Gagタンパク質からなるウイルス様粒子（RS-VLP）にNeospora caninum由来の抗原タンパク質NcSAG1およびNcSRS2（ワクチン候補）を提示させた。二つの抗原を提示したVLPをカイコ幼虫に発現させてOptiprep（コスモバイオ）を用いた密度勾配遠心分離法で部分精製を行った。
3）高免疫応答型多価VLPのワクチンとしての評価：上記2）で精製した抗原提示多価VLPをワクチン候補とした。Neospora caninumをBALB/cマウスに感染実験を行ったところ、Neospora caninumに対する感受性が低かったため、Neospora caninumに対する感受性が高いスナネズミを用いて、再実験を行っている。
上記の結果を一部学会で発表したが、動物実験によるワクチンとしての評価結果が得られたら論文として発表する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ニワトリ肉腫ウイルス（Rous sarcoma virus, RSV）由来Gagタンパク質からなるウイルス様粒子（RS-VLP）にNeospora caninum由来の抗原タンパク質NcSAG1およびNcSRS2の二つのワクチン候補の提示に成功し、ショ糖密度勾配法で精製し、既に二つの抗原提示も確認済である。精製済の抗原提示VLPをBALB/cマウスに接種し、Neospora caninum攻撃実験を行ったが、原虫に対する感受性が低かったことが分かった。その後、Neospora caninumに対する感受性が高いスナネズミに変更して実験を行ったが、感受性が高すぎて動物が死んだため、攻撃する原虫の量を減らし、再実験を行っている。Neospora caninumに対するワクチン研究の文献もない状態で、史上初めての動物実験であったため、平成29年度評価が間に合わなかった。5月中旬評価結果が出るので、1～2か月遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
1）高免疫応答型多価VLP/DNAの作製：抗原を動物の体内に注射する場合、分解されやすく、ワクチンの機能を充分に果たせない場合が多い。そこで、免疫細胞内に遺伝子を導入し、免疫細胞内で抗原遺伝子を発現させることで、抗原の分解によるワクチン価の低下を防ぐことができる。この問題を解消するために、抗原タンパク質を体内で発現するDNAワクチンを作製する。VLPへのDNAの内包法の検討を行い、精製を予定している。免疫細胞での発現ベクターとプロモーターとして、それぞれpcDNA3.1とCMVプロモーターを用い、３種類の抗原タンパク質の遺伝子を発現させる。作製前にHeLa細胞を用いて細胞内抗原の発現条件を最適化してから、VLPに包埋する。
2）高免疫応答型多価VLP/DNAのワクチンとしての評価：前年度同様スナネズミを用いて、ワクチンとしての評価を行うほか、フローサイトメトリーなどを用いて、免疫細胞内での抗原タンパク質の発現を調べ、VLPの更なる高機能化を立証する。
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