| 研究課題/領域番号 |
16H02544
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| 研究機関 | 静岡大学 |
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研究代表者 |
朴 龍洙 静岡大学, グリーン科学技術研究所, 教授 (90238246)
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| 研究分担者 |
加藤 竜也 静岡大学, 農学部, 准教授 (00397366)
宮崎 剛亜 静岡大学, グリーン科学技術研究所, 助教 (30775721)
池 和憲 日本獣医生命科学大学, 獣医学部, 教授 (50159597)
Deo VipinKumar 静岡大学, 国際連携推進機構, 助教 (80569806)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | バイオテクノロジー / ウイルス様粒子 / カイコ / ワクチン / 昆虫 |
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| 研究実績の概要 |
前年度の研究計画に従い、本年度は、下記の二つの研究を遂行した。
1）高免疫応答型多価VLP/DNAの作製：本研究では、密度顆粒タンパク質のDense granule protein 7（GRA7）、ミクロネームタンパク質のMicronemal protein 8（MIC8）及びロプトリータンパク質のRhoptry protein 40(ROP40)を封入対象の抗原遺伝子とし、哺乳類発現ベクターpcDNA3.1(+)をクローニングベクターとした。各遺伝子をクローニングベクターに挿入後、エレクトロポレーション法とバイオビーズSM-2を用いてプラスミドDNAをVLPに封入した。それぞれのDNAを封入したVLPをHEK293T細胞株に導入し、導入から2日後、遺伝子導入を観察した。pcGFP 5をポジティブコントロールとし、GFPの蛍光を観察することで遺伝子導入効率を評価した。この結果、各抗原遺伝子はVLPに封入され、哺乳類細胞発現用ベクターに挿入された。HEK293T細胞への形質導入については、コントロールは成功したが、VLPの形質導入は確認できなかった。VLPの表面糖タンパク質がカイコ由来のBmGP64であるため哺乳類細胞に侵入効率が低いことが理由の一つであると考えられ、今後BmGP64の改変が必要である。
2）高免疫応答型多価VLP/DNAのワクチンとしての評価：上記１）の通り、VLP/DNAワクチンの作製が困難であったため、高免疫応答型多価VLPのみ、ネオスポら感受性が高いスナネズミを用いて、ワクチンとしての再評価を行った。高免疫応答型多価VLPを免疫化後、スナネズミにN. caninum原虫を攻撃したところ、平均体重が61.0 gから64.2 gに増加し原虫からの防御効果が賦与された。生存率は、ワクチン接種群のスナネズミがより長く生存し、血清中抗体産生も確認できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
高免疫応答型多価VLP/DNAの作製：抗原遺伝子を哺乳類発現ベクターに挿入し、哺乳類細胞に導入するまでは成功したが、細胞内での発現が思ったより効率が悪く、動物細胞への形質導入が困難であったことが、高免疫応答型多価VLP/DNAの作製に失敗した原因である。次年度はこの問題を解決するために、今まで用いたエンベロープVLPであるRSV―LP ではなく、抗原の提示やDNAを封入しやすいノンエンベロープVLPを作製し、当初の目標であった高免疫応答型多価VLP/DNAの作製を行う。
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| 今後の研究の推進方策 |
１）単一バクミドによる抗原提示VLPの作製： 複数の抗原を提示するために、複数のバクミドを共発現する方法では、抗原毎の発現量の差が生じる。さらに発現する抗原の種類が増えれば増えるほど発現量が低下する。この問題を解決するためには、複数のタンパク質を同時に発現させることが可能な単一バクミドによる発現系の構築が必要である。
２）高免疫応答型多価VLP/DNAの作製：前年度遺伝子を封入したVLPの哺乳類細胞への形質導入効率が悪かったので、下記のように改良する。扱いが難しいエンベロープVLPを扱いが簡単で発現量も多いノンエンベロープ粒子（SpyTag-SpyCatcherシステム）へと変更する。SpyTagとSpyCatcherは化膿レンサ球菌のフィブロネクチン結合タンパク質FbaBに含まれるドメインであるCnaB2を13残基（SpyTag）と138残基（SpyCatcher）の2つの部分に分割され、別々に発現させ混合すると互いに共有結合を形成することで粒子の作製が可能である。SpyTagとSpyCatcherによる抗原の提示やDNAの封入を行う。SpyTag-SpyCatcherシステムを用いればVLPに提示するのはSpyCatcherのみであるため、抗原提示効率の問題は解決できる。また、複数の抗原を提示したVLPを効率的に構築することも可能である。
上記の研究結果により得られたVLPについて、動物試験を行い、高免疫応答型多価VLP/DNAのワクチンとしての効果を検証する。
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