| 研究課題/領域番号 |
16H02564
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
山羽 悦郎 北海道大学, 北方生物圏フィールド科学センター, 教授 (60191376)
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| 研究分担者 |
藤本 貴史 北海道大学, 水産科学研究院, 准教授 (10400003)
松原 孝博 愛媛大学, 南予水産研究センター, 教授 (60443389)
後藤 理恵 (風藤理恵) 愛媛大学, 南予水産研究センター, 准教授 (70399997)
斎藤 大樹 愛媛大学, 南予水産研究センター, 准教授(特定教員) (90396309)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 始原生殖細胞 / 生殖系列キメラ / 育種 / 魚類 |
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| 研究実績の概要 |
A) 宿主の生殖腺内で培養による育種適合ゲノムの選抜：セルソーターにより魚類の始原生殖細胞（PGCs）を分離する条件の検討、および、分離したPGCsをまとめて移植する条件設定を行っている。ゼブラフィッシュを材料とし、PGCsにGFP蛍光を付与した胞胚由来の細胞より蛍光細胞を分取する条件設定を行った。その結果、回収率約25-50%の割合で蛍光細胞がソートされ、そのうち約95％がVasaタンパク質に対する抗体に反応しPGCsと考えられた。しかし、ソート細胞のホスト胚への移植段階で、①細胞の移植針への挿入、②針内壁への細胞の接着、③針先から宿主胚への移植、の３つの過程で細胞のロスが多く、キメラ胚の誘導が困難であった。キンギョを材料とした場合、その細胞が大きいためにゼブラフィッシュと同様の処理をしても、回収率が低く移植の過程まで至らなかった。
B) 遺伝的多様性を有するPGCの分離：数多くの胚から分離した細胞に含まれるPGCsを簡便に分離する技術の確立を目指している。セルソーティングにおいて、蛍光を付与していない細胞群の細胞分布の中から、蛍光を付与した細胞群のPGCsへの分布位置をソートする可能性を探った。しかしながら、本研究費で購入したセルソーターによる、前方散乱光面積（FSC-A）と側方散乱光面積（BSC）、あるいはFSC-Aと前方散乱光高（FSC-H）による展開では、蛍光付与群のPGCsの予想存在位置には（恐らく体細胞と考えられる）多数の非蛍光細胞が分布した。このことから、当セルソーターを用い蛍光を付与していない細胞群からPGCsを濃縮する事は困難と考えられた。一方、キンギョで遺伝的多様性を誘導するために、多数の個体からの精子凍結保存を試みた。333mMグルコース・9%メタノール溶液を希釈液とした場合に解凍後の運動率が20.9%を示し最も高くなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
始原生殖細胞が大型であるため、セルソートの回収率が非常に悪い。また、ソートした細胞の粘着性が高いため、細胞移植用の顕微注入針の内側に接着する。このような状況から生殖系列キメラの誘導に至っていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
ゼブラフィッシュを材料とし、PGCsにGFP蛍光を付与した胞胚由来の細胞より蛍光細胞を分取する条件設定を行った。その結果、PGCsと考えられる細胞の分取はできた。しかし、ソート細胞のホスト胚への移植において、①細胞の移植針への挿入、②移植針内壁への細胞の接着・残存、③移植針先から宿主胚への移植、の３つの過程で細胞のロスが多く、キメラ胚の誘導が困難であった。キンギョを材料とした場合、その細胞が大きいためにゼブラフィッシュと同様の処理をしても、ソート過程での回収率が低く、移植の過程まで至らなかった。
そこで、本年度はPGCsをソートできると考えられるゼブラフィッシュを材料とし、①-1 移植針への細胞接着を抑制する方法として、ガラス表面へのコーティング法の探索、細胞懸濁液の改良を行う。①-2 ①で改良した移植針へ、ソーティングしたPGCsを多く含む細胞画分を挿入し、宿主胚経の移植方法の改良を行う。①-3 ソーティングしたPGCsを多く含む細胞画分を細胞塊とする手法の開発。①-4 PGCsを含む細胞塊を、宿主胞胚へ移植する技術の開発、を行う。①-5 PGCs画分への移植が可能となった場合、半数体PGCsの宿主への移植を行う。
セルソーティングの過程でPGCsが消失するキンギョにおいては、②-1 細胞骨格を強化する細胞懸濁液の改良を行い、体節形成期以降の小型化したPGCsのソーティングを試みる。ソーティングが可能であれば、①の手法をキンギョPGCsに適用する。
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