| 研究課題/領域番号 |
16H02587
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
甲斐 知恵子 東京大学, 生産技術研究所, 特任教授 (10167330)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | ウイルス / アセチル化 / 脱アセチル化 / 遺伝子発現制御 |
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| 研究実績の概要 |
我々はこれまでに麻疹ウイルスを含むモービリウイルス属が上皮系細胞でハウスキーピング遺伝子群の広範な発現低下を引き起こすことを発見し、この現象に宿主蛋白のアセチル化修飾状態の大きな変動が関与することを示唆する結果を得た。本研究課題では、モービリウイルス感染後の細胞蛋白のアセチル化の全動態を、近年確立された網羅的・定量的アセチローム解析により明らかにし、さらに宿主遺伝子発現変動とウイルス増殖との関与を明らかにすることを目標とする。
１）モービリウイルス感染後の上皮系細胞の定量的アセチローム解析・・・前年度までに作製したサンプルを定量的アセチローム解析に供し、本年度はその解析結果を得て宿主蛋白の継時的なアセチル化変動の全容を見ることができた。
２）hMOFによるハウスキーピング遺伝子群発現制御・・・hMOF分子によるハウスキーピング遺伝子群の発現制御を明らかにするために、昨年度はhMOFおよび関連因子の抗体を用いたChIP-seqの条件検討を行った。本年度は決定した条件を元にサンプル作成を行い、ChIP-seq解析の結果を得ることができた。
３）ウイルス感染によるhMOF分解の宿主遺伝子群発現制御への関与・・・本年度は、hMOFの分解によってhMOF関連因子群の遺伝子発現がオートクラインに抑制されることを明らかにした。
４）脱アセチル化酵素阻害剤のウイルス増殖能抑制効果・・・前年度の研究から、脱アセチル化酵素の一つに対する特異的阻害剤が麻疹ウイルスとの細胞融合の動態を変化させることから、本年度は当該阻害剤と結合する宿主因子の同定を試みた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
１）麻疹ウイルス感染後の定量的アセチローム解析に関しては、前年度までに確立した条件をもとにサンプル調製を行い、本年度は解析結果を得ることができた。その結果、宿主の抗ウイルス因子群でのアセチル化修飾の変動は当初の予想より小さく、他のontologyに分類される蛋白が多く検出されたことから、アセチル化の変動が多岐にわたる細胞機能に影響を及ぼすと考えられた。またこの解析結果に付随して、ウイルス側の蛋白でもアセチル化修飾を受けるアミノ酸部位が検出されたことから、この部位にアミノ酸変異を導入した遺伝子組換えウイルスの作出を試み、成功した。
２）hMOFによる遺伝子発現制御機構については、昨年度までにhMOFおよび関連因子の抗体を用いたChIP-seqサンプルの作出を行い、本年度は解析結果を得ることができた。その結果、これまで報告のあったショウジョウバエ同様、hMOF分子によるChIP-seqにはハウスキーピング遺伝子群のプロモーター領域が濃縮されていることが明らかになり、麻疹ウイルスによるhMOFの分解を介してこの機構が阻害されることを明らかにすることができた。
３）hMOFと高分子複合体を形成するhMOF関連因子の遺伝子プロモーターがhMOF結合プロモーターに含まれていたことから、hMOFの分解に加えてhMOF関連因子の発現低下がハウスキーピング遺伝子群の発現低下に繋がることが示唆された。
４）昨年度まで解析の中で、アセチル化酵素の一つの特異的阻害剤の添加により麻疹ウイルスの増殖が著しく抑制され、それはウイルス膜蛋白と細胞膜の融合過程が影響を受ける結果であることが明らかになった。本年度は当該阻害剤が結合するウイルス蛋白/宿主蛋白の検索のために、ビオチン化阻害剤を合成し、結合蛋白を回収して質量分析を行った。
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| 今後の研究の推進方策 |
これからの研究の方向性について特段の変更はない。
特に、安定同位体ラベル法を用いた定量的アセチローム解析の結果が得られた事から、アセチル化変動の大きい因子に関してまずバリデーションを行い、実際にウイルス感染による修飾変動が確認された際はウイルス増殖への影響について、変異蛋白などを用いて検索していく。興味深いことに、解析で得られた蛋白はこれまでにウイルス感染との関連が報告されているものはほとんどなく、解析を進めることで、ウイルス分野においてアセチル化動態の継時的変化とウイルス感染との相互作用解明として初めての成果となる。
また、hMOFが実際にヒトにおいてもハウスキーピング遺伝子群のプロモーター領域に結合することが明らかになったことから、麻疹ウイルスによるhMOF分解が実際にハウスキーピング遺伝子群の発現低下を引き起こす現象への関与を確認する。
特に、hMOFの分解によってハウスキーピング遺伝子群の発現がオートクラインに低下することが示唆されたことから、遺伝子発現に対するhMOF関連因子群とhMOFの協調と特異性それぞれについてバリデーションを行う。
昨年度までに見出された、脱アセチル化酵素の阻害によるウイルス増殖の抑制に関しては、質量分析によって当該阻害剤に結合する因子を複数同定したが、それらはウイルス増殖との関与が見られなかったため、条件を修正して引き続き関連因子の同定を行う。
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