DNMT1によるポリコム抑制ドメインの形成及びその生物学的な意義の解明

2016 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 16H02622
• 研究機関: 国立研究開発法人理化学研究所
• 研究代表者: 古関 明彦 国立研究開発法人理化学研究所, 統合生命医科学研究センター, グループディレクター (40225446)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: DNMT1 / ポリコム群遺伝子 / CpGアイランド / PRC1 / PRC2

研究実績の概要

DNMT1/NP95経路とポリコム群遺伝子発現抑制の間にあるリンクを詳細に記載するための研究を実施してきた。DNMT1をコンディショナルにノックアウトできるES細胞を用いて、遺伝子発現、PRC1とPRC2の結合パターンを系統的に明らかにした。その結果、多くのポリコム群の標的において、脱抑制、RING1Bの結合量の低下、H3K27me3とPRC2結合の減少が観察された。それに対応して、DNMT1の結合もそれらの遺伝子座においては、多少なりと高くなっていることも見出し、DNMT1は、リピート群だけではなく、長いCpGアイランドにも結合することが明らかになった。RING1Bを含むPRC1は、カノニカルPRC1と異型PRC1の少なくとも2つ以上の複合体として存在するが、KDM2Bを含むPRC1は、カノニカルPRC1 とPRC2に対してエピスタティックに作用することが示されている。おもしろいことに、KDM2Bの標的遺伝子群への結合は亢進していることが示された。しかしながら、野生型とDNMT1欠損細胞でKDM2Bをノックダウンした時、同様なRING1B結合、PRC2結合の低下が観察された。このことは、DNMT1はKDM2Bの下流として作用していることが示された。このことは、PRC2→カノニカルPRC1経路が作用するためにDNMT1は必要とされることを示す。
また、DNMT1の機能発現メカニズムを解析するべく、CpGアイランドにリクルートするために機能するCXXCモチーフ、あるいは、複製フォークへのリクルートに寄与するドメイン、あるいは、メチルトランスフェラーゼドメインを欠損するDNMT1をDNMT1欠損細胞に導入し、安定発現株を樹立した。これらにおいては、DNAメチル化レベルの回復は見られなかったものの、RING1Bの標的への結合は回復しないことが示された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

幾つかの点で、予想とは異なる結果（異型PRC１は機能的な標的ではなかったなど）が得られたため、適宜短期的な目的を修正しながら研究を進行させている。観察そのものの頑健性は実験を積み重ねることで担保されつつあり、順調に進んでいると自己評価する。

今後の研究の推進方策

今までの研究の進行状況を鑑み、29年度は以下のように研究を進行する予定である。
① CGIsにおけるDNMT1とKDM2Bの機能的関連の解析: DNMT1をES細胞においてノックアウトするとRING1BのリクルートメントとH3K27トリメチル化が大きく障害される。PRC1リクルートメントの足場と考えられるKDM2Bの標的への結合を調べたところ、逆にそれが大きく亢進していることが示された。このことは、DNMT1はKDM2BとPRC1の相互作用を調節するメカニズムである可能性を示唆する。今年度は、この可能性を検証するためにDNMT1-KO ES細胞とNP95-KO ES細胞を用いて、PCGF1-PRC1コンポーネントのChIP-seq解析を行う。また、逆に、KDM2B-KO ES細胞におけるDNMT1とNP95のCGIｓへの結合を同様に解析する。
② DNMT1とKDM2Bの複製フォークにおける振る舞い：DNMT1とNP95が複製フォークで作用することはよく知られるところであるが、KDM2Bについてはよく知られていない。複製フォークは、DNMT1とNP95とKDM2Bとの機能的相互作用がおこる場所として最初に検討すべきドメインである。DNMT1-KO、NP95-KO、及び、KDM2B-KO ES細胞を用いて、複製フォークへの DNMT1、NP95とKDM2Bの結合がどのように変化するのか、iPOND法と免疫染色法を用いて、検証する。また、それぞれの変異によってどのように複製フォークの構造が変わるか、iPOND後の材料をプロテオム解析を行う。

研究成果

• [雑誌論文] Gene Resistance to Transcriptional Reprogramming following Nuclear Transfer Is Directly Mediated by Multiple Chromatin-Repressive Pathways. (2017)
  • 著者名/発表者名: Jullien J, Vodnala M, Pasque V, Oikawa M, Miyamoto K, Allen G, David SA, Brochard V, Wang S, Bradshaw C, Koseki H, Sartorelli V, Beaujean N, Gurdon J.
  • 雑誌名: Mol Cell 巻: 65 ページ: 873-884
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2017.01.030.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] PCGF6-PRC1 suppresses premature differentiation of mouse embryonic stem cells by regulating germ cell-related genes. (2017)
  • 著者名/発表者名: Endoh M, Endo TA, Shinga J, Hayashi K, Farcas A, Ma KW, Ito S, Sharif J, Endoh T, Onaga N, Nakayama M, Ishikura T, Masui O, Kessler BM, Suda T, Ohara O, Okuda A, Klose RJ, Koseki H.
  • 雑誌名: Elife 巻: 6 ページ: e27970
  • DOI: 10.7554/eLife.21064.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Loss of Pcgf5 Affects Global H2A Monoubiquitination but Not the Function of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (2016)
  • 著者名/発表者名: Si S, Nakajima-Takagi Y, Aoyama K, Oshima M, Saraya A, Sugishita H, Nakayama M, Ishikura T, Koseki H, Iwama A
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 11 ページ: e0154561
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0154561
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Activation of Endogenous Retroviruses in Dnmt1-/-ESCs Involves Disruption of SETDB1-Mediated Repression by NP95 Binding to Hemimethylated DNA (2016)
  • 著者名/発表者名: Sharif J, Endo TA, Nakayama M, Karimi MM, Shimada M, Katsuyama K, Goyal P, Brind’Amour J, Sun M-A, Sun Z, Ishikura T, Mizutani-Koseki Y, Ohara O, Shinkai Y, Nakanishi M, Xie H, Lorincz MC, Koseki H
  • 雑誌名: Cell Stem Cell 巻: 19 ページ: 81-94
  • DOI: 10.1016/j.stem.2016.03.013.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Functional analysis of AEBP2, a PRC2 Polycomb protein, reveals a Trithorax phenotype in embryonic development and in ESCs. (2016)
  • 著者名/発表者名: Grijzenhout A, Godwin J, Koseki H, Gdula MR, Szumska D, McGouran JF, Bhattacharya S, Kessler BM, Brockdorff N, Cooper S
  • 雑誌名: Development 巻: 143 ページ: 2716-2723
  • DOI: 10.1242/dev.123935
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] ThPOK represses CXXC5, which induces methylation of histone H3 lysine 9 in Cd40lg promoter by association with SUV39H1: implications in repression of CD40L expression in CD8+ cytotoxic T cells. (2016)
  • 著者名/発表者名: Tsuchiya Y, Naito T, Tenno M, Maruyama M, Koseki H, Taniuchi I, Naoe Y.
  • 雑誌名: J Leukoc Biol 巻: 100 ページ: 327-338
  • DOI: 10.1189/jlb.1A0915-396RR
  • 査読あり
• [雑誌論文] Histone H2A T120 Phosphorylation Promotes Oncogenic Transformation via Upregulation of Cyclin D1. (2016)
  • 著者名/発表者名: Aihara H, Nakagawa T, Mizusaki H, Yoneda M, Kato M, Doiguchi M, Imamura Y, Higashi M, Ikura T, Hayashi T, Kodama Y, Oki M, Nakayama T, Cheung E, Aburatani H, Takayama KI, Koseki H, Inoue S, Takeshima Y, Ito T.
  • 雑誌名: Mol Cell 巻: 64 ページ: 176-188
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2016.09.012.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Conversion of T cells to B cells by inactivation of polycomb-mediated epigenetic suppression of the B-lineage program. (2016)
  • 著者名/発表者名: Ikawa T, Masuda K, Endo TA, Endo M, Isono K, Koseki Y, Nakagawa R, Kometani K, Takano J, Agata Y, Katsura Y, Kurosaki T, Vidal M, Koseki H, Kawamoto H.
  • 雑誌名: Genes Dev 巻: 30 ページ: 2475-2485
  • DOI: 10.1101/gad.290593.116
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] The role of PRC1 variants during activation of Meis2 (2016)
  • 著者名/発表者名: 古関 明彦
  • 学会等名: Max-Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics
  • 発表場所: Freiburg, Germany
  • 年月日: 2016-11-11
  • 招待講演
• [学会発表] Regulation of promoter/enhancer interaction of Meis2 by KDM2B (2016)
  • 著者名/発表者名: 古関 明彦
  • 学会等名: Centro de investigaciones Biológicas (CSIC)
  • 発表場所: Madrid, Spain
  • 年月日: 2016-11-07
  • 招待講演
• [学会発表] Polycomb in transcriptional phase transition of developmental genes (2016)
  • 著者名/発表者名: 古関 明彦
  • 学会等名: Mini Symposium, Genetic Control of Mouse embryonic Development at Hubrecht Institute
  • 発表場所: Utrecht, the Netherlands
  • 年月日: 2016-06-30
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] PCGF6-PRC1 to suppress premature activation of meiosis/germ cell related genes in ES cells (2016)
  • 著者名/発表者名: 古関 明彦
  • 学会等名: Trinity College, Oxford University
  • 発表場所: Oxford, UK
  • 年月日: 2016-06-27
  • 招待講演
• [学会発表] PCGF6-PRC1 to suppress premature activation of meiosis/germ cell related genes in ES cells (2016)
  • 著者名/発表者名: 古関 明彦
  • 学会等名: Basel Stem Cell Network, Freidrich Miescher Institute
  • 発表場所: Basel, Switzerland
  • 年月日: 2016-06-23
  • 招待講演
• [学会発表] 形態形成のエピジェネティック制御 (2016)
  • 著者名/発表者名: 古関 明彦
  • 学会等名: 秋田大学大学院医学系研究科・医学部
  • 発表場所: Madrid, Spain
  • 年月日: 2016-06-07
  • 招待講演