| 研究課題/領域番号 |
16H02681
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
猪原 秀典 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (00273657)
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| 研究分担者 |
森下 竜一 大阪大学, 医学系研究科, 寄附講座教授 (40291439)
大野 ゆう子 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (60183026)
真下 知士 大阪大学, 医学系研究科, 准教授 (80397554)
藤堂 剛 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (90163948)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ヒトパピローマウイルス / 中咽頭癌 |
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| 研究実績の概要 |
含嗽検体中のHPV DNA検出感度について検討したところデジタルPCR はnested PCRやGENOSEARCH HPV31と同等であった。
HPV16陽性中咽頭癌動物モデルの開発を目的として、HPVE6(TTL)E7ベクターをマウスの受精卵前核にマイクロインジェクションした。また、変異型PIK3CA (E542, Glu→Lys) を挿入したベクターの作製を完了した。
HPV陽性頭頸部扁平上皮癌細胞株であるUM47およびUM104のE6/E7遺伝子をCRISPR/Cas9システムを用いてノックアウトし、E6/E7タンパクの発現を比較検討したところ、qPCRではmRNAの発現が確認できているにもかかわらずタンパクの発現が親株でも全く確認できなかった。そこで、PA tagを付けたE6/E7発現ベクターを作製し293FT細胞に導入し解析した。抗PA tag抗体はE6/E7タンパクを認識したが、全ての抗E6抗体はE6タンパクを認識せず、一部の抗E7抗体はE7タンパクを認識した。この有効な抗E7抗体を用いた免疫染色は可能であった。以上より、有効な抗E6抗体が存在しないこと（細胞内のE6タンパク発現の評価は不可能）、UM47およびUM104はE7タンパクを発現していないことが明らかとなった。子宮頸癌細胞株Caskiについて検討したところ、同様にE6/E7 mRNAは発現しているがタンパクは発現していなかった。E6/E7タンパクの発現はHPVによる癌化に必須であることから、UM47/UM104/Caskiを用いてこれまで行われてきた多くの基礎実験は全く無意味なものであることが判明した。
HPV DNAのliquid biopsyに関して、血漿からcell-free DNAの抽出、デジタルPCRによるHPV16 E6/E7のコピー数の絶対定量の条件の最適化を完了した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
HPV陽性頭頸部扁平上皮癌細胞株であるUM47およびUM104、更には子宮頸癌細胞株であるCaskiが様々な検討の結果、E6/E7 mRNAを発現する一方でタンパクを発現しないことが明らかとなった。従って、CRISPR/Cas9システムを用いてE6/E7ノックアウト株を作製したものの、タンパクレベルでは親株と差が無いことから、E6/E7ノックアウト後の細胞形質の変化（今回は特に放射線感受性）について検討する意義が無くなった。こうした点では、本研究は当初計画よりやや遅れていると言えるが、一方でこうした知見が得られたことは、HPV陽性中咽頭癌や子宮頸癌の基礎実験を行っている研究者に正しい方向へ転換する契機を与えることになり、大きな朗報と捉えることができる。また、現在市販されている抗E6/E7抗体の全てについて今回客観的な評価を下すことができたので、その意味においてもこの分野に関わる研究者が無効な抗体を用いて無駄な実験をする手間を省く一助となる。一方、我々はHPV陽性中咽頭進行癌を対象とした低侵襲治療の臨床試験を行っており、これに関連してliquid biopsy によるHPV DNAの評価で興味深い知見が得られつつある。
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| 今後の研究の推進方策 |
1）咽頭HPV感染の評価を更に継続して行う。2）HPV陽性中咽頭癌動物モデルであるHPV16 E6/E7トランスジェニックマウス、変異型PIK3CAトランスジェニックマウス、ダブルトランスジェニックマウスの作製を完了させ、その表現型を解析する。3）in vitro実験系で有用性が証明された抗E6/E7抗体が、臨床検体の評価においても有用であるか検討する。これはHPV陽性頭頸部扁平上皮癌細胞株を用いE6/E7ノックアウトによる放射線感受性の評価を行うことが不可能となったことから、その代替として臨床底意義のある研究として行うものである。4）中咽頭癌患者を対象にHPV DNAのliquid biopsyを継続し、その臨床的有用性を証明する
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