| 研究課題/領域番号 |
16H02954
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| 研究機関 | 福岡大学 |
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研究代表者 |
倉岡 功 福岡大学, 理学部, 教授 (60335396)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | DNA修復 / 放射線 / DNA損傷 |
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| 研究実績の概要 |
DNAは遺伝情報を担う重要な物質であり、生命が正常に営まれるためには安定にDNAを維持しなければならない。しかしDNAは放射線、紫外線、化学物質などの外的要因、および細胞の代謝過程で発生する活性酸素などの内的要因により絶えず損傷を受けている。これらのDNA損傷は、細胞死や突然変異を誘発し、ひいては老化・がん化等の原因になる。ヒトを含めた全ての生物はこれらのDNA損傷を修復して遺伝情報を維持することのできる多様なDNA修復機構をもっている。
ヌクレオチド除去修復は、紫外線、化学発がん剤などによって生じる多様なDNA損傷を除去することのできる重要なDNA修復機構である。この修復には、転写機構とカップリングしてDNA損傷の認識が行われる「転写と共役したヌクレオチド除去修復」が存在する。この転写と共役したヌクレオチド除去修復経路には一つの中心的モデルが存在する。１）RNAポリメラーゼが、鋳型領域に生じたDNA損傷に出会う。２）RNAポリメラーゼはこの損傷で転写反応を一時停止する。３）RNAポリメラーゼの停止が一つのシグナルとなってそれぞれの損傷にあった修復タンパク質を呼び込み、その損傷を修復するというものである。
一方、放射線により生じるDNA損傷としてDNA鎖切断がよく知られている。この損傷は複製のみならず転写機構をも阻害し（RNAポリメラーゼは損傷において停止し）、突然変異および細胞死を導くことが予想される。事実、この修復のために細胞は転写機構と協力してDNA鎖切断を修復していることが明らかになった。
この研究は、転写におけるDNA鎖切断の影響および転写と共役したDNA鎖修復の現象を解析し、その修復の分子機構を明らかにすることを目的とする。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究では、転写領域および非転写領域、さらに転写鎖および非転写鎖を区別して切断できるゲノム編集ベクターを作製し、「ヒト細胞における転写と共役したDNA鎖切断修復」の検出法を確立することにし、この実験系を用いて、転写依存的なDNA鎖切断修復の基本修復因子を同定する予定であった。しかしながら、この細胞学的な機能解析によって、転写機構と修復機構を観察することは可能になったものの、完全に二つが共役関係にあるかはまだ定かではなく、その結果からゲノム編集による修復および転写の偏りが存在していることが明らかになった。
またこの成果を踏まえて、ヒト細胞抽出液を用いて転写修復反応系実験を確立し、ヒト細胞抽出液を用いた生化学的な解析が必要になった。この実験系を作成するために、DNA鎖切断を特異的な部位にもつDNA基質を作成することにした。昨年においてはこの作成に時間を費やすことになった。現在さらに基質を作成、その改変を行っている。本年度はこれを用いて、ヒト細胞における転写と共役したDNA鎖切断修復の生化学的な解析する予定になっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究では、転写領域および非転写領域、さらに転写鎖および非転写鎖を区別して切断できるゲノム編集ベクターを作製し、「ヒト細胞における転写と共役したDNA鎖切断修復」の検出法を確立する予定であった。この細胞学的な機能解析によって、転写機構と修復機構を観察することは可能になったものの、完全に二つが共役関係にあるかはまだ定かではなく、その結果からゲノム編集による修復および転写の偏りが存在していることが明らかになった。
またこの成果を踏まえて、ヒト細胞抽出液を用いて転写修復反応系実験を確立し、ヒト細胞抽出液を用いた生化学的な解析が必要になった。そこで転写が観察できる主要後期プロモーターをもつDNA基質を作成し、そのとき転写鎖側に１本鎖切断および２本鎖切断を導入できるように制限酵素部位を導入、さらに損傷を大きさの異なる２つG-lessカセットで挟み込む。このようにすれば大きさの異なる２つの転写産物を生み出すことになり、転写産物を定量的に取り扱いやすくなる。この基質にDNA鎖切断制限酵素で鎖切断を導入する。また、新規のDNA鎖損傷作成法を検討する。
それらの損傷基質プラスミドはアガロースゲル電気泳動により解析し、切断された基質はアガロースゲル上でその泳動速度が遅くなる事で確認でき、この方法により一分子プラスミドの中に一つの損傷をもつ基質が作成されることになる。また、コントロールとして転写できないDNA基質も同様に作製し、試験用の基質として、幾つかの新規のベクターを作製する予定である。
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