| 研究課題/領域番号 |
16H03158
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
近藤 英司 北海道大学, 医学研究院, 特任教授 (60374724)
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| 研究分担者 |
安田 和則 北海道大学, 医学研究院, 名誉教授 (20166507)
近江谷 克裕 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究部門長 (20223951)
小野寺 純 北海道大学, 大学病院, 医員 (90374511)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 移植腱 / 力学的特性 / 靱帯再建 |
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| 研究実績の概要 |
平成28年度は、成羊（サフォーク種）を用いた前十字靱帯（ACL）損傷モデルにおけるTGF-β依存性再生能を有する幹細胞様細胞の本体と機能を生体力学的および分子生物学的に解明し、損傷組織における特異的に高発現する遺伝子群を明らかにすることが予定の計画であった。しかし、当施設への成羊の搬入に困難を有し、再現性を有する成羊を用いたACL損傷モデルの作成に難渋したため、家兎モデルにスケールダウンを行い、ACL損傷モデルの作製およびその生体力学的評価を行った。雌成熟日本白色家兎の右ACL実質部に2 mmの塑性伸び変形を作成し、術直後、術後6週および12週で屠殺した。左側から無処置の膝を摘出し、正常対照群とした。(1) 損傷群の膝前後方向移動距離は、対照群に比べ有意の高値を示した。(2) 損傷群の靱帯長は、対照群に比べ有意の高値を示した。各群の断面積に差はなかった。(3)線形剛性および最大破断荷重は、対照群に比べて有意に低値であった。(4) 組織学的観察では、損傷群のACL実質部内に広範に肉芽様組織形成を認め、膠原線維の配列は不規則であった。次に保存していた成羊膝を用いたACL再建モデルを作製した。新鮮凍結成羊膝を用いて移植腱を被損傷靱帯組織で被覆させた群（被覆群）と、その処置を行わなかった群を作製した（非被覆群）。移植腱は、半腱様筋腱を採取し、Endobutton-CLとポリエステルテープを直列結合した無細胞マトリクスを作製した。次に専用ガイドを用いて大腿骨および脛骨のACL付着部に6 mmの骨孔を作製した。被覆群では、腱マトリクスを被損傷靱帯組織の中を通して移植し、膝屈曲60度の肢位にて初期張力40Nを与え、screw固定した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成28年度は、成羊（サフォーク種）を用いた前十字靱帯（ACL）損傷モデルにおけるTGF-β依存性再生能を有する幹細胞様細胞の本体と機能を生体力学的および分子生物学的に解明し、損傷組織における特異的に高発現する遺伝子群を明らかにすることが予定の計画であった。しかし、当施設への成羊の搬入に困難を有し、再現性を有する成羊を用いたACL損傷モデルの作成に難渋したため、家兎モデルにスケールダウンを行い、ACL損傷モデルの作製およびその生体力学的評価を行った。保存していた成羊膝を用いて今後計画している前十字靱帯損傷および再建モデルを作成し、その再現性を生体力学的に評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
(1) 前十字靱帯損傷（羊）モデルにおいて、前十字靱帯損傷後１、２、４週においてこの組織に出現する幹細胞様細胞を分離し、正常組織と比べて特異的に高発現している遺伝子を、マイクロアレイを用いて網羅的に解析する。そこで高発現する幹細胞マーカーおよび主要な機能分子についてRT-PCR、Western blot、および免疫染色等を用いて遺伝子およびタンパクレベルで確認する。さらにその機能分子が靱帯基質の力学的特性に与える効果を生体力学的に明らかにすることにより、この細胞の本体とその機能を明らかにする。
(2) 前十字靱帯再建（羊）モデルにおいて、(1)の幹細胞様細胞を被損傷靱帯から関節内移植腱へ遊走させた群と、その処置を行わなかった群を作製する。その後１、４、および12週の各時期において各群の移植腱から細胞を分離し、両群の対比において前者に特異的に高発現している遺伝子を、マイクロアレイを用いて網羅的に解析する。そこで明らかになった主要な機能分子および幹細胞マーカーの発現について、RT-PCR、Western blot、および免疫染色等を用いて遺伝子およびタンパクレベルで明らかにすることにより、この細胞の遊走後の機能の変化を継時的に明らかにする。
(3) (2)の遊走群における移植腱における力学的特性の改善およびメカノ受容器の再生の促進を定量的に計測する。この結果と(2)で特定された機能分子の発現との相関を解析する。また、その分子の阻害がこの相関に与える効果を解析することにより、被損傷靱帯から遊走した幹細胞様細胞が移植腱の再構築過程および神経再生を促進する現象の分子機序を明らかにする。
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