| 研究課題/領域番号 |
16H03277
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
南 篤志 北海道大学, 理学研究院, 准教授 (40507191)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 天然物化学 / 生合成 / 酵素 |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題では、未開拓の研究領域に位置づけられるセスタテルペン（炭素数25）生合成マシナリーに焦点をあて、イソプレノイド生合成における中心的課題の一つであるテルペン環化酵素によるカスケード型環化反応の解明に取り組む。具体的には、①セスタテルペン環化酵素発現ライブラリーの構築を基盤とした酵素機能の系統的な解析、②同定した環化酵素の反応機構解析・立体構造解析、③酵素関与が必要不可欠なステップの特定を通して、提唱した仮説の妥当性を評価する。加えて、特徴的なアミノ酸配列をもつ膜貫通型セスキテルペン（炭素数15）環化酵素をモデルとして、仮説の一般性を検証する予定である。本年度は、主に①と②について検討した。
まず、１０種類以上のセスタテルペン環化酵素遺伝子を公開／パーソナルデータベースから選択し、麹菌発現用プラスミドを構築後、麹菌へと導入した。構築した形質転換体が生産した代謝産物を薄層クロマトグラフィーとガスクロマトグラフィーで分析したところ、６種の形質転換体がセスタテルペンを生産していることがわかった。生産されたセスタテルペンの化学構造は、各種分光学的手法を用いて決定した。次いで、次年度以降に実施する予定である酵素機能の精密解析へ向け、構築した麹菌形質転換体からcDNAを調製し、標的遺伝子を大腸菌発現用ベクターにクローニングした。各遺伝子を大腸菌へと導入して発現誘導したところ、目的とするセスタテルペンの生産を確認できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
データベースに登録されている機能未知セスタテルペン環化酵素の中には、①転写・翻訳を受けていない休眠状態にある遺伝子（覚醒により機能する）や②見かけ上は休眠状態にある機能不全遺伝子（覚醒しても機能しない）が混在しており、塩基配列から予測されたアミノ酸配列だけでは両者を区別することができない。そのため、本研究における最初の課題は、「セスタテルペン環化酵素のアミノ酸配列に着目した系統的な解析」を実現するための基盤となる環化酵素（遺伝子）の取得にあった。この問題の解決には、機能解析に供する標的遺伝子の選択と数が重要であると考え、十分に精査した１０種類以上の環化酵素遺伝子の機能解析を行い、６種のセスタテルペン環化酵素の機能解析に成功した。また、各環化酵素の組換えタンパク質の調製にも成功した。以上の実験により、環化酵素のアミノ酸配列と環化生成物の構造を対応づけ、提唱した仮説を検証するために必要な実験材料を得ることができたと考えている。以上のことから、本研究は順調に進展しているものと判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
提唱した環化仮説を実証するには、①セスタテルペン環化酵素の系統的な解析と②酵素機能の精密解析が必要不可欠である。①については、次年度以降もテルペン環化酵素遺伝子の機能解析を継続することで、質・量ともに充実した環化酵素遺伝子の取得に努める。加えて、酵素機能の精密機能解析へ向けた検討も開始する。具体的には、①調製した組換え酵素を用いた部位特異的な変異の導入実験による環化機構の制御、②構造解析へ向けた組換え酵素の結晶化の検討（部分発現したドメインでの検討を含む）に取り組む。①の実験において、特異な化学構造をもつセスタテルペンを生産する環化酵素が取得できた場合、反応機構解析において鍵となる“水素原子の移動”と“炭素骨格の変換”を明らかにするためのラベル化実験も並行して検討する。
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