研究課題
本研究は、生理活性物質として主に薬学領域、特に生薬学・天然物有機化学や、農学・食品科学分野で注目され研究が展開されているプレニル化フェノールの生合成に関する研究である。化合物としては1,000種ほどが同定されているプレニル化フェノールであるが、その生合成に関しては、筆者らがフラボノイドに対する最初のプレニル化酵素を発見してからまだ１０年程度であり、膜結合型酵素であることもあり本酵素ファミリーの全体像の把握にはまだ程遠い。本年度は、この膜結合型タンパク質の結晶化に向けた基盤として、これまで筆者らが取得して来た８種の植物科にまたがる10属あまりの植物種に由来する29個のプレニル化酵素遺伝子を網羅的に発現スクリーニングに供し、N-末端ならびにC-末端にGFPあるいはGFP-His のタグを付加した58種のコンストラクトを作成し、タンパク質発現、可溶化、アフィニティー精製の順に実験に供した。実験の効率化のため、ホストは出芽酵母とし、gap repair cloning により一連の実験を遂行した。その結果、58種の発現プラスミドの内、GFP融合タンパク質の蛍光が認められたものが９種、可溶化が達成できたものが４種、Ni-NTAにより精製までできたものが２種類であった。しかし最終ステップまで達成した２種のプレニル化酵素についても、タンパク質の絶対量が結晶化に供するのには著しく不足であることが判明した。これと並行して、結晶化が不可能だったことを想定し、各酵素の特徴的な化学的性質を元にドメインシャフリングを介した酵素機能とアミノ酸配列の相関について生化学的データを収集し、古細菌から得られた本ファミリーの結晶構造を基にしたモデリングにより、生化学データに裏打ちされた３次元構造の構築を行った。
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
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