| 研究課題/領域番号 |
16H03283
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
松井 健二 山口大学, 大学院創成科学研究科, 教授 (90199729)
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| 研究分担者 |
肥塚 崇男 山口大学, 大学院創成科学研究科, 助教 (30565106)
河内 孝之 京都大学, 生命科学研究科, 教授 (40202056)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ゼニゴケ / 油体細胞 / 二次代謝産物 / 化学防衛 |
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| 研究実績の概要 |
ゼニゴケ油体細胞の１細胞トランスクリプトーム解析を進めた。当初、葉状体切片内の油体細胞内容物をマイクロキャピラリーで吸い取ることを試みたが、油体細胞壁が硬く、細胞が破裂することが多かったため油体細胞特異的に内容物を吸い取るのが困難であることが明らかとなった。プロトプラスト化を試みた。細胞壁分解酵素を組合わせた被子植物細胞プロトプラスト化条件ではゼニゴケ葉状体からプロトプラストを調製できなかった。そこで、0.7 Mマンニトールによる高浸透圧下で原形質分離を起こし、カミソリ刃で組織を細断する方法を採用した。その結果、数は少ないものの油体細胞プロトプラストを取り出すことに成功した。油体細胞プロトプラストをキャピラリーで吸い取り、RNAを単離、cDNA化、増幅し、次世代シークエンサー解析を実施した。油体細胞特異的マーカー遺伝子としたMpTPS7は油体細胞特異的に発現量が高いことが確認され、油体細胞特異的転写物プロファイルが得られていると考えられたが、別の油体細胞特異的マーカー遺伝子のMpSYP12Bは発現量が低いためか検出できず、また、ひとつひとつの細胞での発現プロファイルが予想以上に異なっており、効率的に油体細胞特異的発現遺伝子群を同定できなかった。これは油体細胞がその成熟の程度などによって遺伝子発現プロファイルを大きく変えるためと考え、油体細胞を成熟度によって分ける技術の確立と、細胞ひとつひとつの個性を平均化するため、一定数以上の油体細胞をまとめてトランスクリプトーム解析に供する必要を認めた。そのため、高浸透圧条件での細断法の高効率化による大量の油体細胞プロトプラストの調製と、セルソーターによる分画技術の確立を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の目的であったゼニゴケテルペン合成酵素群の解析についてはほぼ終了し、関連遺伝子群のうち、油体細胞特異的と考えられるテルペン合成酵素群を絞り込み、その発現制御様式を明らかにした。
もうひとつの目的である１細胞トランスクリプトーム解析については予備的なトランスクリプトームデータの収集は終え、その結果に基づいて実験系の最適化を進めている段階にある。本研究期間内に解析を終了させ、油体細胞特異的発現遺伝子を同定し、その機能の推測が可能となっている状況にある。
変異体単離については既に10,000株以上をスクリーニングし、三次スクリーニングに至った株を数株単離している。これまでは顕微鏡下での油体細胞確認であったが、現在は油体細胞特異的代謝産物であるマルカンチンをHPLC分析する方式も採用し、より広範囲でスクリーニングが可能となっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
油体細胞特異的遺伝子のプロファイリングに関してはトランスクリプトーム解析を進めるが、その材料として(1)一連の生育ステージにある油体細胞の分別、と(2)効率的な油体細胞プロトプラストの単離による油体細胞の平均化、のふたつのアプローチを取る。どちらの場合も葉状体細断により更に効率よくプロトプラストを取る技術の確立と葉肉細胞など他の細胞を除く細胞峻別技術の確立が必須である。後者に関してはセルソーターの活用を進める。
一方、スクリーニングで得られた変異体株についてはTak1と戻し交雑し分離系統で次世代シークエンスにより変異箇所の同定を進める。同定できた遺伝子については順次正常遺伝子を戻して変異表現型の原因遺伝子であることを確認し、引き続いてその機能を明らかにする。ゼニゴケの組み替えは２ヶ月程度で終えられるため本研究期間中に完了させることが可能である。
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