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H30年度はRNA定量発光プローブの開発を中心に行った。具体的には独自に開発したmPUMテクノロジーと二分割NanoLucを用い、標的RNAに結合すると発光能を回復するRNA発光プローブの開発を重点的に行った。前年度にmPUMと二分割RNAからなるプローブが、標的RNAの存在によって発光を示すという予備実験を行っていた。H30年度は二分割NanoLuc断片をタンデムにつないだものなどを作成し、もっとも高い発光能を示すものをスクリーニングした。その結果、N末端側断片、C末端側断片共に1つのみを有するプローブが、最も高いシグナル/ノイズ比を示した。この結果より、今後の実験ではRNA発光プローブとしてN末端側断片、C末端側断片共に1つずつを有するものを用いた。また、mPUMドメインは、過去の研究で実績のあるマウスβアクチンmRNAを標的とするものを用いた。
本プローブの遺伝子をマウス線維芽細胞株NIH3T3細胞にリポフェクションにて導入した。この細胞が示す発光値をマルチウェルプレートリーダーを用いて測定した。コントロールとして、標的RNAを有しないヒト由来HEK293細胞にプローブ遺伝子を導入したものも作製し、動揺に発光値を測定した。その結果、HEK293細胞と比較してNIH3T3の方が有意に高い発光値を示した。遺伝子導入効率はNIH3T3よりむしろHEK293細胞の方が高いことから、本プローブはNIH3T3内に存在する標的RNAを認識し発光を示していることを強く示唆している。続いてNIH3T3細胞にプローブ遺伝子を導入したものを発光顕微鏡を用いて観察した。その結果、プローブが発現した細胞において、細胞質に発光が確認できた。すなわち、顕微鏡下で1細胞より高解像度で標的RNAの可視化を実現した。
以上のように、H30年度はRNA発光プローブを開発し、1生細胞RNA可視化解析を実現した。
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