| 研究課題/領域番号 |
16H04676
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| 研究機関 | 立命館大学 |
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研究代表者 |
三品 昌美 立命館大学, 総合科学技術研究機構, 教授 (80144351)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | シナプス形成 / シナプスオーガナイザー / 細胞接着分子 / 脳の発達 / 脳高次機能 / 精神疾患 / 神経回路 |
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| 研究実績の概要 |
知的障害や自閉症の原因分子であるシナプスオーガナイザーIL1 receptor accessary protein like 1 (IL1RAPL1) と相互作用する蛋白質を網羅的に単離するために以下の実験を行った。マウス大脳皮質神経細胞の初代培養細胞とIL1RAPL1のN末端領域を結合させた磁気ビーズとを共培養し、シナプス形成を誘導する。シナプス形成誘導後に、細胞膜透過性および非透過性のクロスリンカーを作用させることによりIL1RAPL1のN末端領域に結合するシナプスオーガナイザーならびにシナプスオーガナイザーと相互作用する細胞膜および細胞内蛋白質を共有結合で安定化する。界面活性化剤処理により細胞を可溶化し、磁気によりIL1RAPL1と相互作用する蛋白質群を単離精製した。得られた複合体を還元剤DTTで処理することによりクロスリンカーを切断した後、タンパク質分解酵素で処理することによりペプチドに限定分解し、高速液体クロマトグラフィー/質量分析計でアミノ酸配列を決定した。同定されたシナプス前部蛋白質のcDNAを単離し、発現ベクターを用いてHEK293T細胞に発現させ、シナプスオーガナイザーIL1RAPL1-PTPδとの結合活性を検定することにより、シナプス形成誘導時にシナプスオーガナイザーIL1RAPL1-PTPδと相互作用する蛋白質群を同定することに成功した。同様に、小脳シナプスオーガナイザーGluRδ2-Cbln1-neurexinと相互作用する蛋白質群を同定した。また、flox-Nrxn1, flox-Nrxn2, flox-Nrxn3マウスと小脳顆粒細胞特異的Creマウスと掛け合わせることにより、小脳顆粒細胞特異的neurexin triple KOマウスを作成した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
脳の発達と高次機能には神経細胞間の精緻なシナプス結合の形成が必須である。さらに、シナプス形成の破綻は精神疾患の病因になることが広く認識されている。我々は、小脳特異的グルタミン酸受容体GluRδ2がシナプス前部のneurexinとCbln1を介してシナプス形成を制御することを明らかにした。さらに、知的障害の原因となるIL1RAPL1がPTPδと結合し大脳皮質のシナプス形成を誘導することを見出した。シナプスオーガナイザーの実体が明らかとなってきたが、これらの相互作用がどのような機構でシナプス前部のactive zoneやシナプス後部のPSDなどのシナプス構造の形成を引き起こし、機能的なシナプス形成を導くのかは全く不明のままである。さらに、シナプス形成の特異性を決定する機構に関する情報も断片的である。本研究では、脳シナプスオーガナイザーの知見を基に、シナプス形成の特異性と共通性を担う機構の解明を目指した。このために、我々はシナプスオーガナイザーを用いて初代培養神経細胞のシナプス形成を誘導する条件において、細胞膜透過性および非透過性のクロスリンカーを作用させることにより細胞膜接着分子であるシナプスオーガナイザーと相互作用する細胞膜および細胞内分子を網羅的に探索するunbiased screeningを計画し、実施した結果、実際に相互作用する分子群を見出すことが出来た。
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| 今後の研究の推進方策 |
シナプス形成誘導時に大脳皮質神経細胞シナプスオーガナイザーIL1RAPL1-PTPδあるいは小脳シナプスオーガナイザーGluRδ2-Cbln1-neurexinと相互作用する蛋白質として単離し、シナプスオーガナイザーとの結合活性を確認した分子をマウス大脳皮質あるいは小脳初代培養神経細胞に発現させ、シナプス形成誘導に対する影響をアクティブゾーン蛋白質Basoon やシナプス小胞蛋白質VGluT1 の集積を定量することにより検定する。また、これらの蛋白質をコードするmRNA に対するanti-sense RNA を初代培養神経細胞に導入することによりノックダウンし、IL1RAPL1あるいはGluRδ2からのシナプス形成誘導への影響を検定する。さらに、レンチウイルスベクターを用いてマウス大脳皮質神経細胞に導入、発現させ、in vivoシナプス形成を促進するかをBasoon やVGluT1 の集積を定量することにより検定する。網羅的なunbiased screeningにより多くの分子群を得ているので、これらの解析を通じて、絞り込みを行い、最終的には少数の分子について遺伝子改変マウスの作成も進める予定である。
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