研究課題
我々は、蛍光蛋白Venusをレポーターに用いて、マウスES細胞で発現がON/OFFを繰り返す遺伝子を同定した。さらに、この遺伝子のON/OFFに応じて、ES細胞の細胞集塊の形態が変化することも見出した。これより、この遺伝子の発現の変動は、マウスES細胞の多能性の変動を反映する可能性が示唆された。さらに、Venusが挿入されたゲノム領域には、類似の配列をもつ遺伝子がクラスターをなして存在することも見出し、このクラスター全体がES細胞の多能性を制御している可能性も示唆された。本年度は、Venus発現レベルの変動とES細胞の多能性との関係を調べるために、Venus陽性ES細胞とVenus陰性ES細胞をcell sorterで分離後、マウス初期胚への注入によりキメラマウスを作製し、キメラ率を評価した。まず、sorting前のES細胞の品質自体を評価するために、Venusをノックインした複数のES細胞株について、sortingを行わない状態でのキメラ率を調べ、標準的なキメラ率を示すES細胞株を特定した。このES細胞株に対して、cell sorterを用いて、Venus陽性、陰性の細胞を分画してキメラマウスを作製したところ、Venus陰性のES細胞において、高いキメラ率を示した。これより、我々が新規に特定した遺伝子発現の揺らぎが、ES細胞の多能性の揺らぎを反映することを証明できた。さらに、このキメラマウスを野生型マウスと交配させて、Venusをノックインしたマウス系統を樹立した。このマウスは、今後、Venusが挿入した遺伝子の発現部位を個体レベルで解析するために有用と考えられる。Venusの挿入部位の遺伝子クラスターの機能を調べるために、前年度に作製したguide RNAの発現ベクターを用いて、本遺伝子クラスター全体の欠失を試みた。その結果、一方のアレルが欠失したES細胞株を得ることができた。
2: おおむね順調に進展している
Venusの発現レベルによるES細胞のsortingとキメラマウスの作製実験から、我々が新規に同定したES細胞の揺らぎが、ES細胞の多能性の揺らぎを反映することを証明できた。これは、本研究課題で最も重要な検討項目であった。sorting前の細胞の品質評価に時間を要したものの、上記の最重要項目を達成できたことから、研究はおおむね順調に進展していると考えている。
遺伝子クラスターの欠失実験を継続し、両アレルともに破壊したES細胞株を樹立し、表現型を解析する。Venusの発現状態をマウス個体で解析し、ES細胞で認めた遺伝子発現揺らぎの個体レベルでの意義を検討する。ES細胞の遺伝子発現揺らぎの制御機構を解析するために、１細胞でのATAC-seqやRNA-seqを行う。
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