| 研究課題/領域番号 |
16H04705
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| 研究機関 | 藤田保健衛生大学 |
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研究代表者 |
前田 明 藤田保健衛生大学, 総合医科学研究所, 教授 (50212204)
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| 研究分担者 |
恵美 宣彦 藤田保健衛生大学, 医学部, 教授 (30185144)
白木 良一 藤田保健衛生大学, 医学部, 教授 (70226330)
藤井 多久磨 藤田保健衛生大学, 医学部, 教授 (10218969)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 遺伝子発現調節 / スプライシング / mRNA / 癌 / 品質管理機構 / TSG101 / p53 |
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| 研究実績の概要 |
（１）癌特異的TSG101再スプライシング産物の機能が判明
TSG101は蛋白質は、きわめて多種多様な細胞機能をもっているが、細胞増殖/周期の促進活性が癌に関連する。TSG101には癌特異的な異常スプライシング産物TSG101Del154-1054（以後TSG101Del）があり、以前より種々の癌で観察されてきたにも関わらず、その機能は長らく不明であった。最近、TSG101Del産物が、ユビキチン転移酵素（Tal）を競合阻害する事によって、TSG101蛋白質のユビキチン依存的分解から保護している事実がわかった。TSG101DelはmRNA再スプライシングによって生成するのだから、癌細胞ではmRNA再スプライシングでこの産物が増加しTSG101活性が高まっているに違いない。TSG101は細胞増殖活性がある事から、癌の増殖や悪性化との重要な接点が見えてきた。
（２）mRNA再スプライシング抑制因子候補の発見
癌細胞によってストレス依存性と非依存性の違いがあるが、p53発現上昇によりTSG101Del生成が抑制され、逆にp53発現ノックダウンによりTSG101Del生成が誘導される事がわかった。すなわち癌特異的なmRNA再スプライシング現象が、p53の制御下にある事が明らかになった。mRNA再スプライシング促進・抑制因子の探索は、対象がp53の下流にある因子群に絞る事ができる。一方、１５６種類のRNA結合蛋白質のsiRNAライブラリーを用いた網羅的ノックダウン実験を行い、１つの因子RX（仮称）のノックダウンがTSG101 mRNA再スプライシングを顕著に活性化する事がわかった。RX因子は、癌抑制因子として知られており、実際に正常組織では高発現し、進行癌では殆ど発現していない。よってRX蛋白質は正常細胞において異常なmRNA再スプライシングを抑制している極めて有力な候補因子である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
癌特異的mRNA再スプライシング現象を理解する上で、その制御因子（促進因子・抑制因子）を明らかにする事は、極めて重要である。mRNA再スプライシングが、癌抑制遺伝子の制御下にある事がわかり、その制御下にある因子の探索を計画していた。ところが、１５６種類のRNA結合蛋白質のsiRNAライブラリーを用いた網羅的ノックダウン実験を行ったところ、運良く、一つの因子RX（仮称）が明確に再スプライシングを抑制する事がわかった。
はたしてRXがp53遺伝子の支配下にあるかどうかは、今後の研究の課題である。しかし、mRNA再スプライシング抑制因子の有力な候補が見つかった事がブレークスルーとなり、当初の計画は、より早く進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
（１）RX蛋白質がmRNA再スプライシング抑制因子であるかを検証： 正常細胞におけるRX発現をsiRNAでノックダウンして、mRNA再スプライシング（TSG101Del mRNA産生）が誘導されるかを調べる。逆に、再スプライシング活性が強い悪性度の高い癌細胞で、RX蛋白質を過剰発現させて、mRNA再スプライシングが抑制されるかどうかを調べる。
（２）RX蛋白質の発現がp53の制御下にあるかを検証： p53が高発現してTSG101Del mRNAが産生されない癌細胞（TW01など）で、RX因子のmRNA・蛋白質発現を調べる。逆に、p53が発現しておらず、TSG101Del mRNAが産生される癌細胞（Saos-2など）で、RX因子の発現も調べておく。RX発現がp53発現に依存している結果が得られたなら、p53ノックダウン及び過剰発現によって、RX因子が予想通りに発現制御されているかを確認する。
（３）RX因子のmRNA再スプライシング抑制メカニズムの解明： RX因子は、選択的スプライシングを変化させる事が知られている。mRNA再スプライシングのモデルであるTSG101 mRNAへのRX因子の結合が、mRNA再スプライシングの抑制に必要かどうかを、抗体を用いた免疫沈降後のRT-PCR、そして変異を導入したmRNAのスプライシング解析で明らかにする。また他のスプライシング因子との相互作用は、免疫沈降解析で調べる。
（４）RX因子はmRNA品質管理機構の鍵となっているか？： mRNA再スプライシングしない細胞と、そのRX発現をノックダウンした細胞を用い、TSG101 mRNA再スプライシングの根拠となる投縄状RNA産物を研究所内の次世代シーケンサーで大規模解析する（Lariat-Seqと命名）。もしRXノックダウン細胞で、大規模なmRNA再スプライシングが誘導されたなら、この仮説を支持する。
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| 備考 |
研究室のホームページである。
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