研究課題
利用出来る酸素が少ない環境（低酸素環境）に直面したときの生体の防御反応（低酸素応答）は、（頸動脈小体における呼吸調節や、肺・脳における血管の拡張/収縮のような秒単位・分単位での応答反応を除くと）主に転写因子HIFによって制御されているが、そのHIFも自身の-サブユニット(HIF)の特定のプロリン残基がプロリン水酸化酵素PHD (α-ケトグルタル酸依存的dioxygenase)によって水酸化されることで蛋白分解へと導かれる。すなわち、HIFを介した低酸素応答はプロリン残基の水酸化によって制御されていると言える。このPHDの他にも、我々の身体の細胞内には酸素添加酵素 (oxygenase)が多数存在する。これらの酵素は、それぞれ酸素に対するKm値にこそ差はあるものの、酸素濃度が低下すると酵素活性が低下するのだが、これは即ち、PHDだけに限らず、これらの酸素添加酵素 (oxygenase) の何れもが“低酸素センサー”として機能していると言うことができる。代表的な低酸素センサーであるPHDを阻害すると、転写因子HIF依存的低酸素応答の活性化が観察されるが、申請者の予備実験の結果、よく知られている「PHD-HIF依存的な低酸素応答」以外に、「PHD依存的だがHIF非依存的な低酸素応答」や、ヒストン脱メチル化酵素KDM、DNA脱メチル化酵素TETなどの酸素添加酵素 (oxygenase)のように「PHD非依存的な低酸素応答」が、細胞内エネルギー代謝制御において重要な役割を果たしていることが明らかとなりつつある。今まではPHD-HIFで全て説明されてきた感のある低酸素応答の分子メカニズムではあったものの、本研究では、“HIF依存的/非依存的を問わず、低酸素に対する応答反応の全貌を、低酸素による細胞内の水酸化反応”に焦点を合わせて解き明かすことを目標としている。
2: おおむね順調に進展している
PHD2のHIF以外の基質の探索申請者の基礎実験の結果、生体内でdominantな低酸素センサーPHD2のHIF以外の基質が、細胞代謝制御のうえで重要な働きを担っていることが解っており、PHD2の新規基質の探索は生化学的に非常に重要な意味を持つ。まず、PHD2の既知の基質の、PHD2によって水酸化されるプロリン残基の周囲のアミノ酸配列の比較から、PHD2にはL(XY)LAPという基質認識配列が存在することがわかる。公共データベースを用いたin silico探索でL(XY)LAP配列を持つ蛋白を、PHD2の基質候補としてリストアップした。次いで、それら基質候補の、PHD2による予想水酸化部位を含むトリプシン断片の配列情報を元にして、プロリンが水酸化されたペプチドと水酸化されていないペプチドを合成し、それら水酸化/非水酸化合成ペプチドを分離同定できるLC-MSのコンディションを連携研究者の協力のもとに最適化中である。
水酸化ペプチドの質量分析器 (LC-MS)を用いた検出系が樹立されたのちに、それらの水酸化/非水酸化合成ペプチドをコントロールとして、VehicleあるいはPHD阻害剤で処理したヒトの細胞 (HeLaなどを考慮中)から調製したペプチド断片をLC-MSにて定性解析し、当該蛋白が真にPHD2の基質であることを確認する。また、正常酸素濃度下および低酸素環境下で培養した細胞からトリプシン消化ペプチド断片を調製し、プロリンやリジン残基などのように、水酸化修飾に伴い両群間で質量電荷比m/zが水酸化修飾を受けたアミノ酸の数×16（=酸素原子のm/z）だけ変化したペプチドをLC-MSを用いて同定し、低酸素によって水酸化修飾が変化する蛋白、すなわち新たな低酸素センサー分子を同定する（水酸化プロテオミクス）。
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