研究課題
Ctf18-RFCがリーディング鎖DNAポリメラーゼPolεと複合体になった時に活性型PCNAローダ―として機能する。この複合体によるリーディング鎖側DNAへのPCNAの能動的装着により、２種類の新生DNA間の協調的な配置が行われることを予想した。そこでリーディング鎖型複製フォークの再構築などの生化学的アプローチ、出芽酵母、ヒト細胞によるタンパク質のゲノム動態解析を駆使してCtf18-RFCによる２種類の新生DNA間への協調的なPCNA装着を解析する。まず、Ctf18-RFCのPCNA 装着活性の詳細な解析により、Ctf18-RFCがPolεと複合体を形成した時に、両者が協調的にプライマー DNA 3’末端に結合し、高効率のPCNA装着が発揮されることを示した。このことから、Polε/Ctf18-RFC複合体は、リーディング鎖DNAポリメラーゼの構成要素として機能することを提唱した。またPolε/Ctf18-RFCによるPCNA装着反応で足場になるPolεのDNA合成モードと装着活性が相互排他的になることを示した。このことからCtf18-RFCによるPCNA装着は、PolεのDNA合成に障害がある時に行なわれることを明らかにした。また、ヒト細胞でヘリカーゼ活性を有するCMG複合体の調製を可能にした。これを基にしてCMG/Polε/Ctf18-RFC型フォーク複合体の再構築を行ない、リーディング鎖型DNA合成過程でPCNAが装着される反応を検証可能となった。以上の生化学的な解析に加えて、ヒト細胞でPolεとCtf18-RFCの複合体形成、それによるPCNA装着の機能的な意義を解析するために、 HeLa細胞で、CRISPR-Cas9を使ってゲノム編集でFLAGタグ付きヒトCHTF18とPolε結合性を持たないC末欠損変異型FLAG-CHTF18の発現細胞の作成を進めている。
2: おおむね順調に進展している
初期の達成目標として設定したPolεとCtf18-RFCとの相互作用の詳細についての解析を進め、両者の協調的なプライマー3’末端への集合とPCNA装着過程について新しい知見を得た。まずCtf18-RFCはPolεと複合体となった時にPCNA装着活性を有し、PolεがDNA合成を行なうリーディング鎖側で機能しているモデルが提示した。さらにCtf18-RFCによるPCNA装着は、PolεのDNA合成に障害がある時に行なわれることを明らかにした。これらは、Nucleic Acids Res.に投稿して受理された。出芽酵母でも同様のPolε/Ctf18-RFC複合体が機能していることを示した。さらにこの相互作用が、出芽酵母の染色体安定性に重要であることを示した。この結果は、Genes Cellsに投稿して受理された。出芽酵母の複製因子発現系を作成し、ヒト複製因子で示した特性を出芽酵母の因子で検証することが可能になった。また、活性を有するヒトCMG複合体の調製を可能になった。これを基にしてCMG/Polε/Ctf18-RFC型フォーク複合体の再構築を行ない、リーディング鎖型DNA合成過程でPCNAが装着される反応を検証可能となった。
1.プライマーを配置したssDNA鋳型DNAを使ってリーディング鎖合成に相当するPolεのDNA合成と連動したCtf18-RFCによるPCNA装着様式を解析する。比較対象はPolδを使い、DNA合成時の、経時的なPCNA装着を定量的に解析する。2.昨年度の研究で、Polε/Ctf18-RFCのPCNA装着と足場になるPolεのDNAモードと相互排他的になることを示した。この点に着目して、鋳型DNA配列、ヌクレオチド濃度、阻害剤添加によるPolε活性の低下時のPCNA装着効率の関係を解析する。3.ヒト細胞でヘリカーゼ活性を有するCMG複合体の調製が可能になったことを踏まえ、CMG複合体の調製法を最適化し、CMG/Polε/Ctf18-RFC型フォーク複合体の再構築に十分なCMG複合体の調製を行なう。4.出芽酵母で、FLAG-Ctf18、およびPolε結合性を持たないCtf18としてC末24残基を欠失した変異タンパク質（FLAG-Ctf18ΔC）を発現する株を使い、CHIP法とqPCRでCtf18の局在を解析する。再現性よく新生鎖への局在を示せれば、FLAG-Ctf18ΔC発現株を使って同様の解析を行い、Ctf18の複製フォークへの局在とPolεとの結合の関係を明らかにする。5.ヒトHeLa細胞で、CRISPR-Cas9を使ってゲノム編集でFLAGタグ付きヒトCHTF18とPolε結合性を持たないC末欠損変異型FLAG-CHTF18の発現細胞を作成し、CHIP法によるCHTF18の染色体上の挙動の解析系を確立する
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すべて 雑誌論文 (7件) (うち国際共著 2件、 査読あり 7件、 オープンアクセス 7件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (5件) (うち国際学会 2件、 招待講演 3件) 図書 (2件) 備考 (1件)
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