| 研究課題/領域番号 |
16H04754
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| 研究機関 | 宮崎大学 |
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研究代表者 |
和田 啓 宮崎大学, 医学部, 准教授 (80379304)
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| 研究分担者 |
高橋 康弘 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (10154874)
藤田 祐一 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (80222264)
福山 恵一 大阪大学, 工学研究科, 招へい研究員 (80032283)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 鉄硫黄クラスター / 結晶構造 / 無酸素実験 |
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| 研究実績の概要 |
鉄硫黄クラスター(Fe-S)は、酸素に脆弱なタンパク質コファクターである。Fe-S クラスターが生体内において、どこでどのように生合成されるのか、その分子機構解明は遅々として進んでいない。この原因は、Fe-S クラスターの酸素へ不安定性にあり、遺伝学的には生合成マシナリー群は同定されたものの、合成途上のクラスターを実験的に捉えた例は皆無である。
本課題では、細胞内をミミックした無酸素条件下での機能解析を遂行し、クラスター合成反応を試験管内でコントロールする新たな系(無細胞"ex situ"系)を確立することを目指している。さらに、ダイナミックな構造変化を伴う生合成コア複合体の動きを固定・制御することで、多段階に亘る合成途上の中間体クラスターをトラップし、それらの配位構造から生合成メカニズムを解き明かす。また、無細胞クラスター合成系を利用した新規センサーFe-S タンパク質 CnfR の構造機能解析も展開する。これらの目的を達成するために、本年度は以下の項目を実施した。
・Fe-Sクラスター合成複合体にさまざまな変異を導入し、機能に必要な残基をin vivoアッセイによりスクリーニングした。さらに、幾つかの変異コア複合体を大量に精製し分析した結果、Fe-Sクラスターの生合成に必要な材料（硫黄）をトラップした状態の複合体を作製することに成功した。
・新規センサータンパク質である CnfR の大腸菌における発現系を構築した。発現したCnfRを酸素条件下での精製すると、不安定なFe-Sクラスターは崩壊し、アポ型CnfRを得ることができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成２８度の計画書では、[1]コア複合体におけるFe-S クラスター中間状態をトラップ、[2]CnfR の大腸菌における発現系を構築を掲げていた。途中、菌体ストックしていた超低温フリーザーの故障により、予想外の遅れを生じた。研究計画を見直し、５ヶ月程の計画後ろ倒しに変更して進めることにした。これ以降の計画は、順調に進んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、無酸素環境下でのコア複合体およびCnfRの精製を実施しながら、得られた精製蛋白質を用いた結晶化スクリーニングを並行して進める予定である。この際、結晶化スクリーニングでは専用ロボットを活用することで、必要サンプル量および作業時間を大幅に削減することを図り、効率的な研究推進を目指す。
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